中药穿心莲药效成分的提取和分离鉴定
常用中药穿心莲为爵床科穿心莲属植物穿心莲Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees.的干燥地上部分,秋初茎叶繁盛时采割,晒干。《中华人民共和国药典》(2010版 一部)记载穿心莲:苦,寒;归心,肺,大肠,膀胱经。具有清热解毒,凉血消肿之效,是一种来源广,毒副作用少的常用中草药。临床上常用于治疗感冒,扁桃体炎,支气管炎,急性菌痢,胃肠炎等多种感染性疾病。全世界穿心莲属约有20种,中国约有5种,其他四种为刺穿心莲A.echioides Nees,疏花穿心莲A. laxiflora (Bl.)Lindau,西穿心莲A.serpyllifolia Wight和魏氏穿心莲A. wightiana Arn.exNees,均为药用植物。穿心莲始载于《岭南采药录》,原产于热带及亚热带地区,由华侨引种,现国内华东,华南及西北均有栽培。
穿心莲属植物大都具有良好的药理作用,我国用药多为穿心莲,历代本草书中都对穿心莲的药理作用有记载:《泉州本草》“味苦,性寒,无毒”;“入心,肺二经”。常用于抗菌、抗病毒、舒血管降血压。临床上多用于治疗各种感染性疾病、钩端螺旋体病、肠伤寒、毒蛇咬伤等。
药理作用:包括抗菌,抗炎,解热作用;对心肌缺血具有保护作用;减轻心肌缺血再灌注损伤(IRI)的作用;降压作用;对血管内皮细胞的保护作用等。
临床应用:穿心莲在临床上主要用于治疗心血管疾病,急性上呼吸道感染、婴幼儿慢性腹泻、胃炎和烧伤,并用以辅助药物流产。合用其他中药时,对急性黄疸性肝炎、神经性皮炎、湿疹、血栓闭塞性脉管炎、鼻衄、口腔出血、小儿消化不良、痢疾等疾病的疗效也很好。
文献报道,穿心莲的主要成分为二萜内酯类和黄酮类化合物,其中二萜内酯类成分为穿心莲的主要药效成分。本试验意在从中药穿心莲中提取并分离得到该类成分,并对其作出化学成分的鉴定,开发潜在的先导化合物为进一步开发新药奠定基础。
实验仪器与材料:熔点用YANACO MP-S3熔点测定仪(Yanaco AnalyticalInstruments, Kyoto)测定;
紫外光谱用3D-HPLC中PAD检测器测定;
ESI-MS采用Agilent 1100-LC/MSDTrapSL mass spectrometer (Agilent, USA) 测定;
核磁共振谱采用Bruker ARX-300和 Bruker ARX-600型核磁共振谱仪(Bruker, German)测定;
分析型高效液相色谱:①泵为Waters 600 controller (Waters, USA), 检测器为Waters 996 photodiodearray detector (Waters, USA),色谱柱为安捷伦SB-C184.6 umx150mm
制备型高效液相色谱:①泵为PU-986 intelligent prep. pump (JASCO,Japan), 检测器为UV-975 intelligent UV/VISdetector (JASCO, Japan),
旋转蒸发仪(EYELA);
循环水式多用真空泵(郑州长城);
实验材料
穿心莲药材购自药店
硅胶(100-140目,青岛海洋化工厂);
Sephadex LH-20 (Pharmacia,Sweden );
硅胶薄层板为实验室自制(硅胶为G,板大小分别为10 × 10 cm, 20 × 20 cm, 25.4 × 76.2 mm, 黏合剂为羧甲基纤维素钠,浓度为0.4%,与硅胶比例为3:1);
氘代试剂为CDCl3(上海皓素化学技术有限公司产品);
色谱层析用化学试剂为天津康科德科技有限公司为分析纯或色谱纯。
试验用水为实验室自制
实验部分:穿心莲药材100g,用85%乙醇回流提取两次(第一次8倍量,第二次6倍量),每次两小时,合并提取液, 45℃条件下减压回收溶剂,浓缩后得到总浸膏(AP,12g)。总浸膏分散到5倍量的水中,用等体积的乙酸乙酯萃取三次,合并萃取液,45℃条件下减压浓缩得到乙酸乙酯层浸膏(APE,5g)。运用了反复开放硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、制备薄层色谱以及反相HPLC等手段,对穿心莲的乙酸乙酯层浸膏进行了系统分离并已鉴定化合物为脱3,14-二去氧穿心莲内酯、8(17), 13-ent-labdadien-16,15-olid-19-oic acid、phlogantholide-A和穿心莲新苷,详细分离流程如下:
其中化合物一:3,14-二去氧穿心莲内酯
无色针状结晶 (MeOH),mp 93-94 ℃;10%硫酸乙醇显紫红色,Legal和Kedde试剂反应阳性;UVlmax nm(MeOH): 205;ESI-MS m/z:319 [M+H]+,317 [M-H]-;1H-NMR (300 MHz, C5D5N),δ(ppm):0.67(3H,s,20-Me),0.98(3H,s,18-Me),,3.62(1H, d, J=10.6Hz19-Ha),4.01(1H, d, J=10.6Hz19-Hb),4.76(1H,s,17-Ha),4.96(1H,s,17-Hb),4.77(2H,s,15-H2),7.21(1H,brs,14-H);13C-NMR (75 MHz, C5D5N)
液相图谱如下:
化合物2:8(17), 13-ent-labdadien-16,15-olid-19-oic acid
白色粉末(MeOH); Legal和kedde试剂反应阳性; 1H-NMR (300 MHz, in CDCl3):d 7.08(1H, t,J=1.3 Hz, H-14), 4.75(2H, d, J=1.7 Hz, H-15), 4.61(1H, brs, H-17a), 1.02(3H, s, Me-18), 4.88(1H, brs, H-17b), 3.36(1H, d, J=10.8 Hz, H-19a), 3.64(1H, d, J=10.8 Hz, H-19b),0.68(3H, s, Me-20);13C-NMR (75 MHz, in CDCl3)
化合物3phlogantholide-A
白色粉末(MeOH); Legal和kedde试剂反应阳性; 1H-NMR (300 MHz, in pyridine-d5):d 7.21(1H, s, H-14), 4.77(2H, s,H-15), 4.77(1H, o, H-17a),4.99(1H, s, H-17b), 1.34(3H, s, Me-18),0.90(3H, s, Me-20);13C-NMR (75 MHz, in pyridine-d5):。
化合物1、2、3共薄层情况
化合物4穿心莲新苷
无色针状结晶(MeOH),10%硫酸乙醇显紫红色,Legal和Kedde试剂反应阳性,Molish反应阳性。UVlmax nm (MeOH): 205,取穿心莲新苷对照品,与该化合物进行共薄层,并通过HPLC-PAD同时进针检测,发现薄层色谱为同一个点,HPLC上为同一个正态峰,紫外吸收完全相同。
化合物四与穿心莲新苷对照品共薄层情况
小结与讨论:本次试验我们综合运用硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、PTLC及PHPLC等色谱分离手段从穿心莲药材85%乙醇提取物经萃取后的乙酸乙酯部位中分离得到4个二萜内酯类化合物,对于本实验室开发具有潜在成药的先导化合物奠定了基础。