主题：【第七届原创】红花苜蓿总黄酮对亚硝酸的清除盐作用研究

红花苜蓿总黄酮对亚硝酸的清除盐作用研究

    亚硝酸盐具有一定的毒性，是食品添加剂中急性毒性最强的物质之一。一方面是大剂量的亚硝酸盐进人人体内会造成中毒，另一方面，部分亚硝酸盐在一定条件下会转化为亚硝胺，而亚硝胺是一种致癌物质。亚硝酸盐进人血液后与人体中的血红蛋白结合，使正常的血红蛋白变形，失去携氧能力，导致人体组织缺氧，还会对血管产生扩张作用。一般地，口服亚硝酸盐10min至3h后，可出现头晕、头痛、乏力、胸闷、气短、心悸、恶心、呕吐、腹痛、腹泻等症状;严重者出现意识丧失、昏迷、呼吸衰竭，甚至死亡。另外亚硝酸盐能够透过胎盘进人胎儿体内，6个月以内的婴儿对亚硝酸盐特别敏感，对胎儿有致畸的作用。

    红花苜蓿是一种在在欧洲和亚洲的草地中常见的多年生野生植物，现在已经被移植到北美来种植。在分枝的茎末端生长的红花被认为是其医疗价值的来源，通常会被晒干用作医疗使用。红花苜蓿是很多有价值的营养素的来源，包括钙、铬、镁、烟碱酸、磷、钾、硫胺素和维生素C。红花苜蓿还被认为是异黄酮（一种作用类似雌激素的水溶性化学成分，存在于很多植物中）的最丰富来源之一。

    近年来,随着对自由基研究的深入,人体中的活性氧和自由基被认为是引发衰老、癌变和细胞损伤的重要原因。筛选新的能够清除自由基的抗氧化天然药物成为研究热点,因此,对异黄酮抗氧化作用的研究逐渐引起广大学者的重视。

    本试验旨在探讨红花苜蓿总黄酮对亚硝酸的清除盐作用，,为防癌抗癌及充分利用这一天然资源提供有益的实验依据。

材料与方法

主要仪器：

电热恒温水浴锅

微量紫外分光光度

循环水真空泵

万分之一分析天平

主要试剂：

    葡萄糖，对氨基苯磺酸，亚硝酸钠，α-萘胺，pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液，苯酚，浓硫酸，冰醋酸，以上均为分析纯。

红花苜蓿

蒸馏水

2实验方法

主要试剂的配制;

    葡萄糖贮备液：精密称取葡萄糖对照品100.0mg，用蒸馏水溶解并定容至100mL。

    0.4%对氨基苯磺酸：精密称取对氨基苯磺酸400.0mg溶于100mL 30%醋酸溶液中。

    0.1%α-萘胺：精密称取250.1mgα-萘胺溶解于250mL30%醋酸溶液中。

100mg/kg亚硝酸钠溶液：精密称取50.2mg亚硝酸钠溶于500mL水中。

    pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液：用适量的柠檬酸钠、盐酸、蒸馏水并用酸度计测pH值配溶液500mL。

5%苯酚试剂:精密称取10.0000g,加蒸馏水190g溶解，置棕色瓶中密闭保存。

红花苜蓿总黄酮的提取

称取干燥的红花苜蓿用石油醚浸泡24h,以除去色素和脂溶性杂质，倾出石油醚，药渣中75%乙醇浸泡30分钟,超声提取30分钟，过滤，收集提取液，浓缩干燥得总黄酮。

2.3总黄酮含量的测定

芦丁标准曲线的绘制

    精确吸取芦丁贮备液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL甲醇定容至100mL,。以芦丁溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

样品总黄酮含量的测定：

    准确吸取干燥的红花苜蓿总黄酮100.0mg，定容至100mL，取5.0mL定容至100mL,测定吸光度。

精密度试验

    精密吸取芦丁对照品溶液6份，每份1.0mL，测得各吸光度值,计算吸光度的RSD。

2.4样品对亚硝酸盐清除作用的测定

    原理：样品对亚硝酸盐进行清除后，亚硝酸盐浓度降低，吸光度A降低，亚硝酸盐在弱酸性条件下，与对氨基苯磺酸重氮化后，再与α-萘胺偶合生成红色化合物，进而用分光光度计测出亚硝酸盐含量。

测定方法：

    吸取红花苜蓿总黄酮溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL于50mL容量瓶中加入25mL pH=3.0的柠檬酸钠-盐酸缓冲液，再加入100mg/kg的NaNO2溶液5mL,用蒸馏水 定容至刻度，37℃下恒温1h，然后吸取1mL 反应液于培养皿中，加入0.4%的对氨基苯磺酸溶液2mL, 0.1%α-萘胺溶液2ml,摇匀放置15min后，用分光光度计在525nm处测吸光度值（A_x），同时用相应浓度浸提剂做空白实验（A₀），计算清除率。

结果