主题：【第七届原创】水产品中磺胺类药物检测

水产品中磺胺类药物检测

    磺胺类药物（Sulfonamides, SAs）是一种广谱抗菌药，是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物，是现代医学中常用的一类抗菌消炎药，在临床上主要用于预防和治疗感染性疾病。

    磺胺类药物性质稳定，具有制造成本低、产量大、品种多、使用简便等优点，兽医临床和畜牧养殖业中作为饲料添加剂或动物疾病治疗药物广泛应用。

    但是磺胺药是会引起人过敏性反应，且可能有致癌性，随着社会的发展，磺胺类药物的大量而不合理使用，使其在动物性食品中残留从而引起生态环境污染和人类健康危害的潜在威胁已备受关注，已成为人类亟待解决的重大问题之一，随之各类检测方法也随之应运而生。

    农业部也发布公告（958号公告-12-2007），规定了水产品中13种磺胺类药物残留的限量及测定方法：液相色谱-紫外检测法。

    该标准规定了水产品中13种磺胺类药物，磺胺嘧啶（sulfadiazine）、磺胺噻唑（sulfathiazole）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine）、磺胺5-甲氧嘧啶（sulfameter）、磺胺二甲基嘧啶（sulfamethazine）、磺胺甲氧哒嗪（sulfamethoxypyridazine）、磺胺氯哒嗪（sulfachlorpyridazine）、磺胺6-甲氧嘧啶（sulfamonomethoxine）、磺胺甲基异恶唑（sulfamethoxazole）、磺胺多辛（sulfadoxine）、磺胺异恶唑（sulfafurazole）、磺胺二甲氧哒嗪（sulfadimethoxine）、磺胺喹恶啉（sulfaquinoxaline）残留量的测定。

试样处理

1.样品制备
    虾，去头，去壳，去肠线，取肌肉部分；样品切成不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小块后混合。

2.提取
    将样品解冻，称取5.00g，置于50ml玻璃离心管。然后加入25ml乙酸乙酯，超声1min，加入5g无水硫酸钠，均质机14000r/min均质1min，旋涡混合1min，3000r/min离心10min，将乙酸乙酯层小心转移到100ml梨形瓶中，再向原离心管中加入25ml乙酸乙酯，旋涡混匀1min，3000r/min离心10min，将乙酸乙酯曾合并于100ml梨形瓶中，于30℃水浴中减压浓缩至近干。

3.净化
    先用1ml甲醇溶解上述残渣，再加入1%2ml乙酸溶液，旋涡混匀，超声1民，转移到新的50ml玻璃离心管中，再向梨形瓶中加入1ml甲醇和2ml1%乙酸溶液，旋涡混匀，超声2min，转移到50ml玻璃离心管中。向玻璃离心管中加入8ml正已烷，旋涡混匀，3000r/min离心5min，弃上层正已烷层，再加入8ml正已烷重复操作1次，下层加水6ml稀释，HLB（3ml）固相萃取柱分别先用3ml甲醇和6ml水处理，处理完毕后，加入试样稀释液，再用3ml水和2ml5%甲醇淋洗，最后用10ml甲醇洗脱，洗脱液在30℃减压浓缩至干，用1ml流动相（乙腈+甲醇+2%乙酸溶液=5+10+85）定容，经0.45um微孔滤膜过滤，供液相色谱测定。

色谱条件

检测器：紫外检测器

色谱柱：STC-C18柱，5μm，250mm×4.6mm（i.d）或性能相当者

检测波长：270nm

流动相：乙腈、甲醇和2%乙酸溶液，梯度洗脱参见表1

流速：0.6mL/min

柱温：40℃

进样量：20μL


    13种混合标样0.5ug/ml色谱图：



  样品（虾）添加0.2ug/ml标准品（因为我们手上的样品不含该类物质，为了看效果，做方法，只能人为添加，模拟一个现实的样品）色谱图：

分析步骤及方法验证

1.标准曲线

将13种磺胺类药物标准中间液，用流动相稀释成标准工作液，取20ul进样，以峰高为纵坐标，以标准品中磺胺浓度为横坐标，绘制工作曲线。

2.色谱分析

取20ul进样，记录峰高，响应值均应在仪器检测的线性范围之内，根据标准品的保留时间定性，外标法定量。

3.结果计算

样品中荒；磺胺类药物残留量按照公式（1）计算，

式中：

X——样品中磺胺类药物的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；

C——样品提取液中磺胺类药物的浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V——最终定容体积，单位为毫升（mL）。

m——样品质量，单位为克（g）

4.  验证项目

    a. 适用的浓度范围和样品基体磺胺标准工作液的浓度为：分别准确量取标准中间液适量，用流动相稀释成标准工作液，浓度分别为：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪（0.01μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL）；磺胺喹恶啉（0.02μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL）；样品基体：虾线性方程：

磺胺嘧啶线性方程为：y=0.04194x-0.018001  ，R2=0.9993

磺胺噻唑线性方程为：y=0.063594x-0.023432  ，R2=0.9990

磺胺甲基嘧啶线性方程为：y=0.065969x-0.071324  ，R2=0.9991

磺胺5-甲氧嘧啶线性方程为：y=0.066368x-0.044370  ，R2=1.0000

磺胺二甲基嘧啶线性方程为：y=0.061353x-0.048579  ，R2=1.0000

磺胺甲氧哒嗪线性方程为：y=0.054948x+0.027413  ，R2=1.0000

磺胺氯哒嗪线性方程为：y=0.043806x+0.067603  ，R2=0.9997

磺胺6-甲氧嘧啶线性方程为：y=0.041440x+0.080984  ，R2=0.9996

磺胺甲基异恶唑线性方程为：y=0.043170x+0.018463  ，R2=0.9996

磺胺多辛线性方程为：y=0.036971x+0.016300  ，R2=0.9995

磺胺异恶唑线性方程为：y=0.041563x+0.090825  ，R2=0.9995

磺胺二甲氧哒嗪线性方程为：y=0.059375x +0.011490 ，R2=0.9993

磺胺喹恶啉线性方程为：y=0.030460x+0.013208  ，R2=0.9992

    磺胺类物质：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪在0.01mg/L～1.0mg/L范围内线形良好；磺胺喹恶啉在0.02mg/L～2.0mg/L）范围内线形良好；

    b. 检出限实验检出限：将磺胺混合标准中间液，逐级用流动相稀释，并取20ul进样，记录色谱图，取S/N=10时的溶液浓度，计算方法的检出限。S/N=10时浓度分别为磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪（0.05μg/mL）；磺胺喹恶啉（0.10μg/mL）。

    参照公式（1）计算样品检出限：磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺甲基嘧啶、磺胺5-甲氧嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺氯哒嗪、磺胺6-甲氧嘧啶、磺胺甲基异恶唑、磺胺多辛、磺胺异恶唑、磺胺二甲氧哒嗪（10μg/kg）；磺胺喹恶啉（20μg/kg）c. 精密度实验参照（4.3）样品处理方法，称取5.00g样品，置于50ml玻璃离心管中，精密加入0.5ml（1ug/ml）标准使用液，然后加入25ml乙酸乙酯，超声1min……。

    重复处理6次，分别各取50ul进样，记录色谱图，计算各6次测量的相对标准偏差。