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人体服用盐酸芬戈莫德后的尿液分析
芬戈莫德最初是由冬虫夏草(
子囊菌亚门赤僵菌)
培养液中提取的抗生素成分经化学修饰后合成的免疫抑制剂。芬戈莫德是鞘氨醇的结构类似物,研究显示,该药具有与其他药物完全不同的免疫抑制机制,在体内磷酸化后与位于淋巴细胞上的鞘氨醇-1-
磷酸受体(S1PR)
结合,通过改变淋巴细胞的趋化,促使淋巴细胞在淋巴组织内滞留,从而减少自身反应性淋巴细胞再次进入循环的几率,进而防止这些细胞浸润中枢神经系统(CNS)
。进而达到免疫抑制效果。而且该过程是可逆的,停药后淋巴细胞水平即可以恢复正常。临床研究表明,口服制剂芬戈莫德针对复发-
缓解型多发性硬化症疗效确切,优于目前的常用MS
治疗药物干扰素β-1a
注射剂(Avonex
,已用于多发性硬化症的临床治疗药物)
。芬戈莫德可靶向作用于对中枢神经系统(CNS)
有潜在自身攻击性的淋巴细胞,促进神经保护与修复过程,降低MS
的复发率,延缓损伤的进展过程,减少颅内核磁共振成像(MRI)
病灶的数量,减轻病灶的严重程度。药物及受试者:盐酸芬戈莫德为本所研制,十名男性健康受试者(年龄18
~45
周岁,体重65
±10kg
)。色谱条件色谱柱:Acquity BEH C18 (100mm×2.1mm,1.7
μm)
流动相:A:水(0.05%TFA)B:乙腈(0.05%TFA)
质谱条件Waters LCT Premier XETM
型飞行时间质谱仪,W-
负离子模式;毛细管电压2200 V
;锥孔电压35 V
;离子源温度120
℃;脱溶剂气温度350
℃;脱溶剂气流量10L /h
;锥孔气流量700 L /h
;质量扫描范围m /z 50 ~ 1200
;扫描时间0.2s
。给药方案与样品的收集:人尿液样品的收集五名男性健康受试者(年龄18
~45
周岁,体重65
±10kg
),服药前一周内未服任何药物。服药7
天,每天每人约服240mg
盐酸芬戈莫德片,受试期间统一饮食,自服药时起收集尿液,收集8
天尿液,共收集到120
升尿液。尿液样品的预处理固相萃取柱(
自制ODS
小柱)
,用甲醇活化后待用。取尿样1mL
,用酸调pH
值至5.0
,涡旋,3500prm
离心10min
,上清液上于固相萃取柱,用2mL
水洗涤后,再用5mL
甲醇洗脱,收集洗脱液,减压蒸干,残渣加50%
甲醇200
μL
,涡旋,11000prm
离心10min
,取2
μL
进行分析。结果分析:通过比较人口服盐酸芬戈莫德片后收集的尿液样品、空白尿液样品及分到的代谢产物的高分辨质谱和多级质谱数据,在给药后的尿液中共推测出了8
个代谢(如下图)所有代谢产物的高分辨质谱数据的准确度均小于1PPm
。结果与讨论:1、
经过对于给药人体尿液样品分析,初步推测盐酸芬戈莫德在大鼠体内的代谢产物有8
种,其结构进一步鉴定中。2、
流动相的选择方面进行了优化。流动相的选择主要从溶剂种类和梯度洗脱设置两方面进行优化。分析方法中采用了乙腈作为有机相,原因是乙腈比甲醇具有更大的洗脱强度,从而可以减少色谱峰的展宽,得到较好的峰型,此外,使用乙腈洗脱,其粘度较低,可以减小系统压力。在水相中加入TFA
,可以进一步改善化合物的峰型,减少拖尾,此外,TFA
的存在还可以提高样品在离子源中的离子化效率,因此,使用乙腈-0.05%TFA
水溶液为流动相梯度洗脱,可以使样品分析在 9min
之内完成。