主题：【第八届原创】纺织品禁用偶氮染料测试--色谱柱条件优化区分同分异构体

                                            纺织品禁用偶氮染料测试--色谱柱条件优化区分同分异构体
摘要：本文介绍了纺织品禁用偶氮染料的测定经常遇到的同分异构体而导致的假阳性问题，重点介绍了邻甲苯胺和对氯苯胺2种，采用气质联用仪，对色谱柱条件优化来实现分离的方法，以及在试验过程中的一些经验、体会。
关键词：偶氮染料；同分异构体；假阳性；色谱柱；检测
一、前言
偶氮染料是指染料分子结构中含有偶氮基( —N =N—) 的染料。这类染料具有色谱齐全、颜色鲜艳、色牢度较高、成本低等优点。目前全球有三分之二左右的合成染料属于偶氮染料, 估计约2000 个品种,年产量近60万吨。我国实施的国家强制性标准GB 18401—2010《国家纺织产品基本安全技术规范》中也将可分解芳香胺染料的检测作为其中重要的检测项目。GB/T 17952-2011中规定了纺织品中24种禁用偶氮染料。欧洲REACH法规No 1907/2006附件17中也列举了22种禁用芳香胺。而大多使用气质联用仪来检测。由于气相色谱- 质谱法(gc-MSD 法)是将色谱保留时间和质谱信息相结合进行定性, 因此对具有相同出峰时间和质谱图的同分异构体的鉴别存在一定局限性。本文重点列举了邻甲苯胺和对氯苯胺2种禁用芳香胺及其异构体的优化分离。
二、试验部分
2.1原理
纺织样品在柠檬酸盐缓冲溶液介质中用连二亚硫酸钠还原分解以产生可能存在的禁用芳香胺，用适当的液-液分配柱提取溶液中的芳香胺，浓缩后，用合适的有机溶剂定容，用配有质量选择检测器的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱[/url]仪（gc/MSD）进行测定。 必要时，选用另外一种或多种方法对异构体进行确认。用高效液相色谱-二极管阵列检测器（HPLC/DAD）或气象色谱-质谱仪进行定量。
2.2 主要试剂及设备
甲醇（色谱纯，定容或涤纶产品萃取后溶解转移）
叔丁基甲醚（色谱纯，内标稀释液，过柱子提取液）
无水乙醚（分析纯，过柱子提取液）
氯苯（分析纯，涤纶产品抽提）
柠檬酸盐缓冲液（分析纯）
连二亚硫酸钠（分析纯）
24种偶氮染料混标，300ppm（做定性定量标准曲线）
三种内标标准品：萘-D8, 2,4,5-三氯苯胺，蒽-D10
单标标准品：邻甲苯胺，间甲苯胺，对甲苯胺，对氯苯胺，邻氯苯胺，间氯苯胺。
反应器，恒温水浴锅，硅藻土柱子，旋转蒸发器，气质联用仪

2.4 分析步骤
2.3.1 取有代表性试样，剪成5mm×5mm的小片，混合。从混合样中称取1.0g，精确0.01g，置于反应器中，加入16mL预热到(70±2）℃的柠檬酸盐缓冲液，将反应器密闭，用力振荡，使所有试样浸于液体中，置于水浴中，并在（70±2）℃保温30min，使所有的织物充分润湿。然后，打开反应器，加入3.0mL连二亚硫酸钠溶液，并立即密闭振摇，使反应器再于（70±2）℃中保温30min,取出后2min内冷却到室温。
2.3.2用玻璃棒挤压反应器中试样，将反应液全部倒入提取住内，任其吸附15min，用4×20mL乙醚分四次洗提反应器中的试样，每次需混合乙醚和试样，然后将乙醚洗液滗入提取住中，控制流速，收集乙醚提取液于圆底烧瓶中。
2.3.3 将上述收集的盛有乙醚提取液的圆底烧瓶置于真空旋转蒸发器上，于35℃左右的低真空下浓缩至近1mL，再用缓氮气流驱除乙醚溶液，使其浓缩至近干。用1ml三内标液定容后转移至进样瓶中，上机测试。
2.5 标准曲线
2.5.1 GB/T 17592-2011的限量值为20 mg/kg，EN 14362.1-2012中的限量值为30mg/kg，故配制的标准品浓度应适宜。为了分析方便，将三种内标放在一起（简称三内标），内标物浓度也需合适。
2.5.2 三内标浓度：10mg/l。300mg/L混标稀释梯度为3mg/l、6mg/l、15mg/l、30mg/l。标准曲线的建立是本试验的重要环节，从配制到建立做了完整的谱图。配制表见表1，上机曲线见图1-图5。
                                                  表1 禁用芳香胺标准曲线配制表

name	CAS No.		浓度/ppm		浓度/ppm		浓度/ppm		浓度/ppm		浓度/ppm
toluidine	95-53-4		303.3		30.33		15.165		6.066		3.033
4-dimethylaniline	95-68-1		299.7		29.97		14.985		5.994		2.997
6-dimethylaniline	87-62-7		303.9		30.39		15.195		6.078		3.039
anisidine	90-04-0		300.2		30.02		15.010		6.004		3.002
chloroaniline	106-47-8		305.4		30.54		15.270		6.108		3.054
methoxy-5-methylaniline	120-71-8		301.2		30.12		15.060		6.024		3.012
4,5-trimethylaniline	137-17-7		299.7		29.97		14.985		5.994		2.997
chloro-2-methylaniline	95-69-2		300.5		30.05		15.025		6.010		3.005
4-diaminotoluene	95-80-7		300.7		30.07		15.035		6.014		3.007
4-diaminoanisol	615-05-4		299.9		29.99		14.995		5.998		2.999
naphthylamine	91-59-8		302.0		30.20		15.100		6.040		3.020
nitro-o-toluidine	99-55-8		300.6		30.06		15.03		6.012		3.006
aminobiphenyl	92-67-1		301.7		30.17		15.085		6.034		3.017
phenyllazoaniline	60-09-3		302.9		30.29		15.145		6.058		3.029
aminophenyl ether	101-80-4		302.1		30.21		15.105		6.042		3.021
nzidine	92-87-5		303.0		30.30		15.150		6.060		3.030
4-methylenedianiline	101-77-9		299.1		29.91		14.955		5.982		2.991
aminoazotoluene	97-56-3		300.2		30.02		15.010		6.004		3.002
3-dimethy-4,4-diaminodiphenylmethane	838-88-0		299.5		29.95		14.975		5.990		2.995
tolidine	119-93-7		298.6		29.86		14.930		5.972		2.986
4-thiodianiline	139-65-1		299.7		29.97		14.985		5.994		2.997
3-dichlorobenzidine	91-94-1		301.5		30.15		15.075		6.030		3.015
4-methylene-bis-chloroaninline	101-14-4		297.7		29.77		14.885		5.954		2.977
3-dimethoxybenzidine	119-90-4		300.3		30.03		15.015		6.006		3.003
三内标	D8 10.02 μg/ml;    D10 9.96μg/ml;  2,4,5-三氯苯胺 10.06μg/ml。
D8				9.0180		9.5190		9.8196		9.9198
D10				8.9640		9.4620		9.7608		9.8604
2,4,5-三氯苯胺				9.0540		9.5570		9.8588		9.9594

                    图1 3mg/l 24混标 TIC图


                  图2 6mg/l 24混标 TIC图

                图3 15mg/l 24混标 TIC图

          图4  30mg/l 24混标 TIC图

                  图5 标准曲线线性一览

2.5.3 gc-MS 分析条件
                    图6 仪器分析条件

2.6在对纺织品禁用偶氮染料的测定过程中，由于异构体的存在，并且多数异构体的质谱图很相似，如果保留时间再相同，往往会形成假阳性结果的产生。主要有8种致癌芳香胺及其19种异构体（见图7）。
当前针对有害芳香胺的气相色谱/质谱检测方法，大多采用非极性色谱柱，如HP-5MS，DB-5MS，这些色谱柱普遍存在的缺点是对常见的芳香胺异构体不能很好的分离。本试验针对邻甲苯胺和对氯苯胺及其异构体，采用DB-5MS色谱柱。当然，方法有很多，根据实验室条件参考选择，有的可用乙酰化后实现分离，也有的用高效液相色谱仪快速分离。本实验室由于没有高效液相色谱仪等条件，选择了优化色谱柱条件。而采用2.5.3的升温程序无法使其分离开来，于是尝试了很多升温程序，最终实现了间甲苯胺、对氯苯胺与其它两种异构体的分离。
            图7  8种致癌芳香胺及其19种异构体

2.6.1 邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺
  三者间沸点分别为199.7℃、203.3℃、200.5℃，相差较小，在谱图上的匹配度相近，采用图8的分析条件难以区分。可用乙酰化方法分离，邻甲基乙酰苯胺出峰最早。尝试几次升温程序后，采用图9的升温程序，邻甲苯胺最先出峰，保留时间提前了0.2min左右（16.245→16.031），而间位和对位的保留时间相差0.03，但不影响准确定性结果。见图8-图11.
        图8 仪器软件上方法分析条件（图6中的分析条件）

        图9 邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺TIC 图

            图10 邻甲苯胺分离优化条件

    图11  优化条件后邻甲苯胺、间甲苯胺、对甲苯胺TIC 图

2.6.2 对氯苯胺、间氯苯胺、邻氯苯胺
对氯苯胺、间氯苯胺、邻氯苯胺的沸点分别为232℃、230-231℃、208.8℃。邻氯苯胺的沸点低，易区分，而对位、间位难以区分。乙酰化方法也不能有效分离。尝试几次升温程序后，对位、间位得到了很好的区分，同时也做了加标的分离谱图。
              图12 对氯苯胺分离优化条件

        图13 对氯苯胺、间氯苯胺、邻氯苯胺  TIC图

    图14 优化条件后 对氯苯胺、间氯苯胺、邻氯苯胺  TIC图

                  图15  图14放大后的谱图

      图15 优化后加标谱图（对氯苯胺中加同等浓度的间氯苯胺）

三、结论
本文针对纺织品禁用偶氮染料的检测，依据GB/T 17592-2011及EN 14362.1-2012，从标液的配制到标准曲线的建立，在实验室有限的条件下，尝试了不同的色谱条件，针对纺织品禁用偶氮染料的检测中同分异构体中的2种（领甲苯胺和对氯苯胺），优化了升温程序，使同分异构体得到了很好的分离。
参考文献
GB/T17592-2011,《纺织品禁用偶氮染料的测定》
EN 14362-1-2012 纺织品 从偶氮着色剂衍化的某些芳族胺的测定方法
胡小钟，余建新等.禁用偶氮染料检测中假阳性结果的鉴别方法.分析化学研究报告.2000，28(4):411-416.
季浩，染料产品中几种常见有害芳香胺异构体的鉴别 .染料与染色研究论文 第44卷第6期Vo1．44 No．6