主题：【第十届原创】【我爱创新】分散液液微萃取-气相色谱法快速测定水中15种硝基苯类物质

0 引言
    硝基苯类物质是含硝基的单环芳烃的通称，一般包括硝基苯、硝基甲苯、硝基氯苯等，都是重要的化工原料，用途广泛。硝基苯类物质具有显著的毒性，是环保部门重点监控的污染物之一。我国环保标准“GB3838-2002 地表水环境质量标准”中对集中式生活饮用水地表水源中多种硝基苯类物质进行了严格的限制，其中2, 4-二硝基甲苯的限值低至0.3μg/L。
    水中硝基苯类物质的测定可以采用气相色谱法或液相色谱法，其中气相色谱法应用较广泛，是现行的标准方法。例如：
水质硝基苯类化合物的测定液液萃取/固相萃取-气相色谱法. 中华人民共和国国家环境保护标准, HJ 648-2013.
水质硝基苯类化合物的测定气相色谱-质谱法. 中华人民共和国国家环境保护标准, HJ 716-2014.
    由于水中硝基苯类物质含量很低，又存在基体干扰问题，所以需要通过液液萃取或固相萃取等方法进行分离富集之后再进行色谱测定。液液萃取法较为简便，但需要消耗大量的样品和有毒溶剂，而且富集效果并不理想，为了获得较高的富集倍率，往往还需要进一步蒸发浓缩。固相萃取法的富集效果较好，但仍然存在试样和溶剂用量大的问题，而且耗时很长。固相微萃取法（solid-phase microextraction， SPME）、单滴萃取法（single drop microextraction， SDME）、顶空溶剂微萃取法（headspace solventmicroextraction, HSME）也应用于水中硝基苯类物质的分离富集，具有富集效果好和溶剂用量少的优点，但达到萃取平衡十分缓慢，耗时很长。分散液液微萃取法（DLLME）是近年来出现的一种新型萃取方法，具有操作简便、萃取速度快、溶剂和试样用量少等众多优点，应用日益广泛。
    本实验室近期开发了分散液液微萃取-气相色谱法快速测定水中15种硝基苯类物质的方法，主要流程如下：

相关研究已经投稿《分析化学》，现就实验方法相关内容进行介绍。
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2 实验
2.1 仪器
    日本岛津GC2010气相色谱仪，配不分流直接进样口（WBI-2010）和电子捕获检测器（ECD-2010）。
    弹性石英毛细管色谱柱，型号分别为DB-1（甲基聚硅氧烷固定相）、DB-5（5%苯基-甲基聚硅氧烷固定相）、DB-35（35%苯基-甲基聚硅氧烷固定相）、DB-17ms（50%苯基-甲基聚硅氧烷固定相）、VF-1701ms（14%氰丙基苯基-甲基聚硅氧烷固定相）、VF-WAXms（聚乙二醇固定相）、DB-FFAP（硝基对苯二甲酸改性聚乙二醇固定相），规格均为30m×0.32mm×0.25μm。
    萃取容器为10mL尖底玻璃离心管（带磨口塞）。微量注射器分别为5μL、500μL，美国SGE公司。
2.2 试剂
    标样：15种硝基苯类物质见表1，用甲醇配制成浓度为1.00g/L的单标储备液。使用时稀释成所需浓度的混合工作标液。
    萃取剂：氯苯，分析纯，重蒸三次后使用。
    分散剂：甲醇，色谱纯。
    实验用纯水为亚沸蒸馏水。

2.3 色谱条件
    最优条件为：使用DB-35色谱柱。高纯氢气（99.999%）为载气，恒线速度控制（65cm/s）。程序升温，初始80℃保持2min，以5℃/min速率升温至180℃，保持5min。ECD检测器温度220℃，尾吹气为高纯氮气（99.999%），流速40mL/min。WBI不分流直接进样口，温度200℃，进样1.00μL。
2.4 萃取条件
    最优条件为：水样经0.45μm尼龙滤膜过滤，移取5.00mL于尖底玻璃离心管中，用微量注射器将100μL氯苯（萃取剂）与400μL甲醇（分散剂）的混合液迅速注入到水样中，加塞轻摇约30s，得到均匀乳状液。以6000r/min速度离心2min破乳。弃去上层水相，吸取下层沉积相进行色谱分析。
2.5 定量
    （1）方法一：采用简单标液定量，即将工作标液用萃取剂（氯苯）进行稀释，直接进样1.00μL建立工作曲线，计算萃取液中目标物的浓度，结果除以富集因子（近似为50）得到原水样的浓度。
    （2）方法二：采用基体匹配的标样定量，即工作标液用基体（纯水）进行稀释，按试样完全相同步骤进行萃取和测定，建立工作曲线，直接计算原试样中目标物浓度。
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3 讨论
3.1 色谱条件
3.1.1 色谱柱选择
    首先需较好的惰性。硝基苯极性很强，若惰性不足，将会严重拖尾。
    其次液膜要较薄。薄液膜可获得较高的相比，可以减少流出时间。硝基苯类沸点较高，而且在高温下不稳定。高相比可以使目标物流出更快、流出时的柱温更低，减少了样品分解的可能。
    不同固定相对异构体的分离效果是可以预见的，一般极性越强对于异构体的分离度越大。但是非异构体之间的重叠问题难以预测，只能通过实验确定。
    7种不同固定相在同样色谱条件（见2.3）下的分离效果如下，色谱峰编号见表1：


    上述结果较为明确，DB-5和DB-35都可以实现分离，DB-35的效果更好。
    有两点需要指出：
    一是PEG类的固定相对于二硝基苯类物质不适用，表现为峰高显著减小。这一现象的原因尚不清楚，推测可能是由于部分目标物在高温下能够与聚乙二醇固定相发生反应而分解。这并非偶然现象，在环保标准的编制说明中也有报道，参见：
环境保护部办公厅函:环办函93号. http://www.mep.gov.cn/gkml/hbb/bgth/200910/t20091022_174970.htm
环境保护部办公厅函:环办函1052号. http://www.mep.gov.cn/gkml/hbb/bgth/201309/t20130917_260339.htm
    另一点是，MS柱与对应的非MS虽然标称具有相似的极性，但选择性上会有细微的差异。对于本文设计的目标物，使用DB-35柱分离效果很好，换成DB-35MS柱，则存在部分物质难分离的现象。经优化条件不能改善DB-35MS柱分离不完全的现象，说明其根本原因在于固定相选择性的差异。因此在方法验证时，对不同柱的微小差异要十分重视，不能简单的把不同型号但略有类似的产品进行简单替换。
3.1.2 柱温的优化
    本方法采用不分流进样，为了避免进样产生的峰展宽，必须使用较低的初始柱温，使溶剂和目标物在柱头冷凝聚焦。初温80℃时可以获得尖锐的峰型，且溶剂峰完全不拖尾。
3.1.3 检测器温度的优化
    由于ECD的响应信号具有温度敏感性，本文考察了检测器温度在220℃ ~ 280℃范围内变化时各目标物响应信号的变化，结果表明，各目标物的峰高随检测器温度变化不明显，但溶剂峰的强度随检测器温度的降低而减弱。因此选择220℃作为ECD检测器的温度对减弱溶剂峰的干扰比较有利。考虑到检测器温度太低可能导致目标物冷凝而污染ECD，因此没有在更低的检测器温度下进行实验。

3.2 萃取条件的优化
    该萃取方法的关键在于：
（1）萃取剂密度比水大；
（2）分散剂与萃取剂和水都能完全互溶；
（3）混合液在注射过程中实现分散；
（4）分散液的接触面积大，很快就达到萃取平衡，一般只需振荡30s；
（5）通过离心可简便的分离萃取液。
    相关讨论予以简化，只给出结论和最佳条件：
（1）比较了二硫化碳、氯苯、1, 4-二氯丁烷、二氯甲烷、1, 2-二氯乙烷等5种萃取剂。其中二氯甲烷、1, 2-二氯乙烷在水中溶解度太大，进行微萃取时基本上都溶解到水中，不能使用。二硫化碳、氯苯、1, 4-二氯丁烷都可以进行萃取，其中氯苯的萃取率最高。当氯苯用量为100μL时，所有目标物的萃取率都可以达到90%以上，富集因子接近50倍。
（2）以400μL甲醇作为分散剂效果最好。
（3）萃取30s即可达到平衡，延长时间萃取率无变化。
（4）温度，水样中酸度，盐析剂等条件对萃取率影响不大。
3.3 方法学评价
    相关数据从略，主要结论如下：
（1）对于水溶液试样，在0.200 ~ 50.0 μg/L范围内均有很好的线性响应，相关系数不低于0.998。
（2）仪器对各目标物的检出限为0.5 ~ 2.3 pg。方法检出限0.01 ~ 0.05μg/L，方法定量限为0.03 ~ 0.15μg/L。
（3）在0.200 μg/L的加标水平下，方法的相对标准偏差在3.3% ~ 8.9%之间，加标回收率在86.0% ~ 103.5%；在中、高浓度水平下，方法的相对标准偏差均不超过5%，加标回收率在94.5% ~ 101.5%之间。
（4）以现行国标方法作为对照方法，对同一加标试样进行了测定，所得结果具有一致性。
    某试样和试样加标0.200 μg/L的色谱图如下，A为原试样，B为加标样，色谱峰编号见表1：


3.4 方法的特点
（1）富集50倍，灵敏度高。
（2）萃取全过程只需3~5min，速度快。相对的，国标固相萃取法需要约2小时处理试样。
（3）萃取剂用量仅为100μL，试样用量仅为5mL，用量大为减少。相对的，国标法需要使用约500mL样品和10mL萃取剂。
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4 展望
    目前看来，这个新方法有较大优势，但在实际应用中是否能够适应各种复杂样品还有待验证。希望该方法能够在更广泛的范围内试用，也希望各位同仁能够提出相关的问题和改进意见。