主题：【第十一届原创】多功能净化平台在脱氢乙酸检测前处理中的应用

多功能净化平台在脱氢乙酸检测前处理中的应用

武向勇，张佳佳，赵昀，封同月

（山西省食品质量安全监督检验研究院，山西太原  030012）

摘要：建立了一种脱氢乙酸样品前处理的自动化净化方法，优化了自动化净化条件。制备后的样品液相色谱检测结果：脱氢乙酸的回收率为75% ~115%，精密度相对偏差小于6.0%。分析检测结果表明与国家标准方法比较，该前处理方法安全、环保、高效、可靠，提高了脱氢乙酸前处理的效率；分析检测结果的稳定性、准确度、精密度均有一定程度的提高。
关键词：多功能净化平台；脱氢乙酸；液相色谱
      我国食品中脱氢乙酸的液相色谱检验方法是依据国家标准GB5009.121-2016第二法进行检测。样品前处理过程中，对C18固相萃取柱的净化方法为人工手动完成固相萃取柱的活化、上样、淋洗、洗脱等步骤。人工方法处理过程费时费力，稳定性欠缺，净化效果往往不是很好也不稳定，所用的有机溶剂易挥发，污染环境，对操作人员的身体健康造成伤害。但目前自动化和高通量的样品前处理方法鲜见报道，笔者研究了多功能平台在脱氢乙酸的前处理中的净化条件，并与国家标准方法进行了比较，以期运用于自动化批量检测提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器设备
    多功能进化平台：Freedom EVO 100-8 SPE型；
    高效液相色谱仪：Agilent1260型；
    数控超声波清洗器：KQ5200DE型；
    高速离心机；TDL-5-A型；
    pH计：PHS-3C型；
    C18固相萃取柱：500mg，6mL。
1.1.2 试剂
    脱氢乙酸标准品，纯度≥99.5%；
    甲醇（色谱纯）
    乙酸铵（分析纯）
    氢氧化钠（分析纯）
    甲酸（分析纯）
    硫酸锌（分析纯）
    脱氢乙酸标准储备液（1.0mg/mL）。
1.1 方法
1.2.1 多功能净化平台对脱氢乙酸的前处理方法
      准确称取2 g-5 g试样，置于50 mL容量瓶中，加入约10 mL水，用20g/L氢氧化钠溶液调pH值至7.5，加水稀释至刻度，摇匀，置于离心管中，4000 r/min离心10 min。取20 mL上清液用10 %甲酸溶液调pH值至5，定容到25 mL。分2次移取5mL待净化液，以17 μL/s的流速过已活化的固相萃取柱后，用2000 μL空气吹扫；分2次移取5 mL水，以17 μL/s的淋洗速度淋洗固相萃取柱后，用2000 μL空气吹扫；用2 mL 70 %甲醇溶液洗脱，以17 μL/s的洗脱速度进行洗脱后，用1000μL空气排干小柱，收集洗脱液2 mL，涡旋混合，过0.45μm有机滤膜，供高效液相色谱测定。
1.2.2 液相色谱测定
      色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；流动相：甲醇+乙酸铵溶液（体积比：10+90）；流速: 1.0 mL/ min；波长：293 nm；进样量：10 μL。
      根据保留时间定性，外标峰面积法定量。
1.2.3 试验设计
      多功能净化平台可精确控制加液流速和空气吹扫体积，可以减少手动加液和吹扫带来的溶液交叉污染、净化淋洗洗脱不完全和时间的浪费，可以让净化、淋洗和洗脱三个步骤效率 达到最佳。由于多功能净化平台实际流速范围位4.17 μL/s ~ 4167 μL/s，选取8、17、35 μL/s三个加液流速进行选择。经过试验，选取1000μL、2000μL、3300μL三个空气吹扫体积进行选择。
      本研究进行单因素试验，确定多功能净化平台的最佳净化条件。同时，进行此方法稳定性、精密度试验和与GB 5009.121-2016（第一法）前处理方法进行对比。
2 多功能净化平台条件的优化选择
2.1 多功能净化平台加液流速的选择
      称取四种类型试样各7份，每份5.0 g。每种试样中一份为本底样，三份为一组加入一种含量的脱氢乙酸标准溶液。每组试样在净化过程中只改变净化、淋洗、洗脱三步骤中的一个加液速度，其余过程按照多功能净化平台对脱氢乙酸的前处理方法处理。采用高效液相色谱仪测得脱氢乙酸含量并计算回收率。结果见表1。
表1  不同加液流速下的脱氢乙酸回收率

食品 名称	加标量 (mg/kg)	待净化样液流速 （μL/s）			淋洗液流速 （μL/s）			洗脱液流速 （μL/s）
		8	17	35	8	17	35	8	17	35
		回收率（%）			回收率（%）			回收率（%）
橙汁	20	92.1	93.2	75.2	93.2	91.2	80.6	91.2	90.4	83.1
	100	95.2	94.9	74.8	94.9	95.3	79.3	95.3	98.3	85.2
糕点	40	93.2	95.8	78.1	95.8	94.9	82.1	94.9	94.3	83.7
	400	90.7	96.2	79.2	96.2	95.2	80.6	95.2	93.4	82.1
桃罐头	100	96.7	95.6	73.8	95.6	97.1	75.4	97.1	95.3	80.7
	200	92.4	93.2	70.6	93.2	96.4	79.3	96.4	96.5	85.3
酱腌菜	80	93.2	90.1	75.9	90.1	91.0	77.1	91.0	92.1	79.3
	200	91.7	90.7	76.8	90.7	89.9	72.6	89.9	94.2	84.5

      由表1对比可得，加液流速太小，净化时间过长；加液流速太大，导致脱氢乙酸难以完全吸附在固相萃取柱上也不能完全洗脱下来。从实际检测和数据准确性考虑选择多功能净化平台加液流速控制均为17μL/s（相当于1mL/min）。
2.2  多功能净化平台吹扫空气体积的选择
      称取四种类型试样各7份，每份5.0 g。每种试样中一份为本底样，三份为一组加入一种含量的脱氢乙酸标准溶液。每组试样在净化过程中只改变上样、淋洗、洗脱三步骤中的一个空气吹扫体积，其余过程按照多功能净化平台对脱氢乙酸的前处理方法处理。采用高效液相色谱仪测得脱氢乙酸含量并计算回收率。结果见表2。
表2 不同空气吹扫体积下脱氢乙酸回收率

食品 名称	脱氢乙酸 加标量 (mg/kg)	空气吹扫体积（μL）
		上样后			淋洗后			洗脱后
		1000	2000	3300	1000	2000	3300	1000	2000	3300
		回收率 (%)
橙汁	20	75.4	85.3	86.3	85.3	91.0	83.4	93.5	90.4	90.1
	100	70.6	87.6	89.4	87.6	97.8	81.5	98.8	95.3	95.9
糕点	40	69.4	82.4	81.0	82.4	92.6	79.6	96.4	94.3	92.1
	400	66.8	83.4	82.0	83.4	95.2	82.3	97.2	93.4	92.1
桃罐头	100	70.1	85.1	86.1	85.1	96.1	83.4	98.1	95.3	94.1
	200	67.2	80.6	83.1	80.6	98.3	82.1	98.3	96.5	92.1
酱腌菜	80	68.9	80.1	84.1	80.1	90.1	75.6	99.1	92.3	89.7
	200	72.3	82.1	83.1	82.1	94.9	79.4	96.9	94.2	94.8

      由表2对比可得，上样和淋洗后空气吹扫体积太小和太大都导致脱氢乙酸不能完全吸附在固相萃取柱上或者净化不完全；洗脱后空气吹扫体积太大对脱氢乙酸的回收率没有太大影响。综合考虑，确定上样和淋洗后空气吹扫体积均为2000μL，淋洗后空气吹扫体积为1000μL。
2.3 方法与国标的符合性
      多功能净化平台的最佳净化条件：加液速度为17μL/s，上样和淋洗后空气吹扫体积均为2000μL，淋洗后空气吹扫体积为1000μL。在此条件下，脱氢乙酸回收率在91%~99%之间，符合GB/T 27404-2008的要求。
3 多功能净化平台稳定性、精密度试验及与国家标准方法的比较试验
3.1  多功能净化平台稳定性试验
      多功能净化平台设备具有8个独立移液通道，所以选取4种不同基质的空白样品，向样品中加入相同含量脱氢乙酸标准溶液，提取后采用多功能净化平台进行前处理，测定脱氢乙酸含量并计算回收率，进行稳定性试验。结果见表3。
表 3  同一时刻同一加标量的不同基质空白样品中脱氢乙酸回收率稳定性实验（n=6）

脱氢乙酸加标量 40mg/kg	苹果汁		橙汁		糕点		葡萄汁
回收率（%）	38.2	37.6	38.7	38.1	36.1	35.8	36.9	35.2
	95.5	94.0	96.8	95.2	92.6	89.5	92.2	88.0

        由表3可得，不同基质空白样品加标溶液中脱氢乙酸回收率均在80%以上，变化幅度很小，稳定性良好。
3.2 多功能净化平台准确度试验
      选取不同类型的样品，加入不同含量的脱氢乙酸标准溶液，提取后采用多功能净化平台进行前处理，测定脱氢乙酸含量并计算回收率，进行准确度试验。结果见表4。
表4 不同加标量的不同样品中脱氢乙酸回收率准确度实验（n=6）

样品 名称	脱氢乙酸含量 (mg/kg)	脱氢乙酸加标量 (mg/kg)	加标后测得脱氢乙酸含量 (mg/kg)	回收率（%）
橙汁	0	20	18.2	91.1
		40	37.5	93.8
		100	98.4	98.4
糕点	0	40	36.9	89.9
		200	198	99.1
		400	402	100.5

      由表4可以看出，不同加标量的不同样品中脱氢乙酸回收率在89.9~100.5%之间，符合GB 5009.121-2016《食品安全国家标准 食品中脱氢乙酸的测定》在添加浓度2 mg/kg~10 mg/kg浓度范围内，回收率在80 %~110 %之间的要求。
3.3 与国家标准方法的精密度比较试验
      为验证本方法的可行性、可靠性和准确性，选取了具有代表性的空白样品分别采用多功能净化平台的方法和国家标准方法进行了脱氢乙酸回收率与精密度比较试验，结果见表5。
表5 采用多功能净化平台方法和国家标准方法的脱氢乙酸回收率及精密度比较实验（n=6）

样品 名称	加标量 (g/kg)	手动方法				多功能净化平台方法
		结果（n=6）	平均 结果	回收率（%）	RSD（%）	结果（n=6）	平均 结果	回收率 （%）	RSD （%）
面包	0.3	0.27	0.24	80.0	8.5	0.26	0.27	90.0	5.5
		0.25				0.25
		0.24				0.29
		0.21				0.28
		0.26				0.27
		0.24				0.26
	0.5	0.46	0.45	90.0	5.62	0.46	0.48	96.0	2.82
		0.48				0.48
		0.41				0.49
		0.43				0.5
		0.46				0.48
		0.46				0.49

        表5可以说明：两种方法均符合国家标准要求，但采用多功能进化平台的前处理方法得到的脱氢乙酸回收率均高于手动固相萃取净化方法，相对标准偏差均低于手动固相萃取净化方法。可见，本方法具有较高的精密度和可靠性，减少了偶然误差。
4 结论
      多功能净化平台的最佳净化条件为：加液速度为17μL/s，上样和淋洗后空气吹扫体积为2000μL，洗脱后空气吹扫体积为1000μL。此条件下，样品中脱氢乙酸含量回收率为75%~115%，RSD小于6.0％。 与国家标准方法相比，采用多功能净化平台进行脱氢乙酸前处理，在符合国家标准GB 5009.121-2016（第一法）和GB/T 27404-2008要求的前提下，减少了试剂的交叉污染和净化洗脱效率的不完全不稳定，确保了脱氢乙酸含量回收率的稳定性、提高检测结果的准确度和精密度，缩短了约1/2的净化时间，提高了检验人员的工作效率并保障了检验人员的人身安全。
参考文献（略）