主题：【第十三届原创】动物疫病荧光定量PCR检测方法的模块化构建及实践

动物疫病荧光定量PCR检测方法的模块化构建及实践

1 背景

近几十年来，动物疫病的发生与发展越来越趋向频繁、复杂，造成的危害也不断加重。究其原因：一是动物数量大幅度增加，集约化程度不断提高。据《中国统计年鉴》：1990年底全国猪、羊存栏分别为5668万头、11362万头，2015年底则分别为45803万头、31174万头，分别增加7.08倍、1.74倍；二是动物调运频繁、距离不断延长。以前动物调运仅限省内或周边省市，现在动辄上千公里甚至数千公里。据报道：“从2013年底到2014年的上半年，我国新疆、甘肃、内蒙古、宁夏等省区接连爆发了较为严重的小反刍兽疫疫情，而后疫情逐渐扩展地全国20余个省份，造成了严重的经济、社会影响”（《中国畜牧业》2014年第21期《小反刍兽疫爆发对我国肉羊产业发展的影响》）。三是人畜共患病种类不断增加。2012年6月加拿大Haroling教授报告，目前人类已发现1000多种动物病原体，其中有600种存在于家畜之中，在这600种病原体中有40%的病原体为人畜共患病。从国内情况看，进入21世纪以来，禽流感（H5亚型、H7N9）、甲型H1N1流感、SARS、猪链球菌病2型、布氏杆菌病、结核、乙脑、狂犬病等人畜共患病不断发生。

为确保公共卫生安全，以及畜牧业健康发展，有必要实施动物疫病的核酸监测，尽早发现疫情隐患并予以及时处置，避免重大动物疫情及公共卫生安全事件发生。

2 常用试剂盒的缺点

目前，动物疫病（主要指病毒病）核酸检测一般采用商品化荧光PCR试剂盒，多由双组分组成且独立保存，使用前按一定比例（一般PCR反应液与酶混合液体积比为9:1）混匀后用于检测。这种试剂盒存在几个缺点：

一是只能用于某一特定的动物疫病检测，如果检测任务中途发生大幅度削减，则试剂盒只能作报废处理；

二是试剂盒中有的组分容易缺斤少两，尤其是酶混合液更是如此。每个样品约需酶混合液1.2μL，一般10T试剂盒装量为15μL，50T试剂盒酶混合液装量为70μL，按理说应该足够使用。但实际检测中会出现10T试剂盒酶混合液只能检测7T，50T试剂盒酶混合液只能检测40T，严重影响检测工作的正常开展。分析其原因，可能与容器密闭不严、酶混合液中的水分在冰冻状态升华等有关；

三是试剂盒中的引物探针信息缺失。出于保护商业秘密考虑，几乎所有试剂盒均对引物探针的具体序列进行保密。作为第三方检测机构，在开展检测工作时，应优先使用标准方法，并确保使用标准的有效版本。在使用标准方法前，应进行证实。在使用非标准方法（含自制方法）前，应进行确认。但由于试剂盒厂家不提供引物探针序列，检测机构无法判定使用试剂盒开展的检测是否符合标准方法的要求。

另外，商品化试剂盒一般免费附带核酸提取试剂，但提取试剂根据检测项目的不同，一般为DNA专用提取试剂或RNA专用提取试剂。当一批样品要检测多种DNA及RNA病毒项目时，需要同时进行两次核酸提取，不仅费时费力且浪费试剂。

由于上述缺点的存在，给动物疫病检测带来了不少麻烦。

3 模块化检测方法的构建思路

针对商品化试剂盒存在的缺点，进行了模块化检测方法的构建。总体思路是：将动物疫病荧光定量PCR检测分为三个模块，核酸提取采用DNA/RNA共提试剂，核酸扩增采用预混液+引物探针方式，质控品利用抗原或商品化疫苗自制。具体思路如下：

——核酸提取采用DNA/RNA共提试剂；

——引物探针严格按照标准方法，委托生物工程公司合成；

——反应体系中其他成分，采购商品化qPCR预混液或RT-qPCR预混液（含逆转录酶）；

——质控品：阳性对照采用病毒抗原、商品化疫苗等，测定结果后按一定比例稀释，保存备用。

——反应体系：一律固定为20μL，具体如下：

DNA扩增	RNA扩增
qPCR预混液（2×）  10μL	RT-qPCR预混液（2×） 10μL
	逆转录酶                1μL
ROX                0.4μL	ROX                  0.4μL
引物探针            适量	引物探针                适量
水              补足18μL	水                  补足18μL
DNA模板            2μL	RNA模板                2μL

——反应条件首先按照标准中的条件开展摸索，如达到预期效果则予以固定；如效果不佳则参照预混液及引物探针推荐条件进行适当调整。

根据上述思路，一个实验室只需配备DNA/RNA共提试剂、qPCR预混液、RT-qPCR预混液共3种试剂，加上特定的引物探针，即可开展多种动物疫病的检测。此配置有以下优点：

一是试剂通用性强。实验室只需配备DNA/RNA共提试剂、qPCR预混液（针对DNA病毒）、RT-qPCR预混液（针对RNA病毒）三种主要试剂，以及不同的引物探针，即可开展几种甚至几十种检测项目；

二是灵活方便。根据动物疫病的发生发展，实验室可以随时调整检测项目和检测数量。以RT-qPCR预混液为例，不仅可以用于检测禽流感，也可以用于检测口蹄疫、猪瘟、蓝耳病等项目。实验室常备一定数量的预混液，当某个项目检测量突然增加时，可利用预混液的通用特性，迅速完成检测任务，尔后再采购预混液进行补充。当某个项目因故取消时，也可将预混液用于其他项目的检测，不致于造成大量浪费。

三是方便开展项目检测。当突发新的重大疫情，上级有关部门公布引物探针序列及扩增程序后，可以委托生物工程公司紧急合成引物探针，利用现有的预混液，在几天内即可具备新方法的检测能力，而这一点是成品试剂盒很难做到的。

4 质控品制备

对于病毒核酸荧光定量PCR检测，每次实验都必须设立阴性对照和阳性对照。一般情况下，在核酸提取和核酸扩增，需分别设立阴性对照和阴性对照，也就是说每次检测至少需要设立E-（核酸提取阴性对照）、E+（核酸提取阳性对照）、R-（核酸扩增阴性对照）、R+（核酸扩增阳性对照）共4个质控。在开展多次检测，结果稳定后，可以仅使用E-/E+或R-/R+。

阴性对照可用DEPC水，阳性对照是否可以利用商品试剂盒附带的质控品？经过部分项目的检测，证明大部分商品试剂盒附带的质控品，均无法作为实验室自制的准标准方法的阳性对照。原因可能是商品试剂盒质控品系根据其专有的引物探针（与检测标准不一致）扩增片段制成质粒，只能使用其特有的引物探针才能检测到。因此，需要自制阳性对照用于质控。

对于基层实验室来说，制备质粒或者假病毒非常困难，较可靠的办法是直接利用全病毒来制备阳性对照，具体思路如下：

——对于禽流感、新城疫、口蹄疫等项目，由于商品化试剂盒附带有全病毒抗原，可以尝试使用这些抗原来制备阳性对照；

——对于蓝耳病、伪狂犬、圆环病毒、小反刍兽疫等项目，由于已经有商品化疫苗上市，可以尝试使用商品化疫苗来制备；

——对于部分既无全病毒抗原又无商品化疫苗的检测项目，在不违反法律法规及部门规定的情况下，可以利用已确认阳性的病毒核酸，适当稀释后作为核酸扩增阳性对照（R+）；或者将病毒核酸用已灭活的阴性血浆作适当稀释，复原成模拟阳性样品，作为核酸提取阳性对照（E+）。

5 应用

根据上述思路，进行了相关实验，取得了初步成果。现简要汇报如下：

——核酸提取采用FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒，南京诺维赞生产，可以实现多种样品的DNA/RNA共提；

——引物探针按照相应国家标准提供的序列，委托上海生工合成，引物稀释成10μmol/L、探针稀释成5μmol/L，分装成小包装冷冻保存备用；

——qPCR预混液采用AceQ Universal U+ Probe Master Mix V2，RT-qPCR预混液采用2× One Step Q Probe Mix，逆转录酶采用One Step Q Probe Enzyme Mix，均为南京诺维赞生产；

——质控品：禽流感选用血凝抑制抗原，口蹄疫选用液相阻断ELISA抗原，其他选用商品化疫苗，测定结果后用灭菌水稀释至Ct值约25~30，冷冻保存备用；

——反应体系：设置为20μL，预混液（2×）10μL、逆转录酶1μL、ROX 0.4μL为固定量，引物探针加入量根据检测标准中的终浓度予以换算，加灭菌水补足18μL，DNA或RNA模板为2μL；

——反应条件：绝大多数项目直接套用检测标准中的反应条件，效果良好不需要调整。

6 讨论

6.1 检测工作更加简捷高效

模块化检测方法，极大地方便了检测工作的开展。目前实验室经常开展的检测项目有10余个，如果采用商品化试剂盒，则每个检测项目需专用的试剂盒，采购、保存和使用等各个环节，均显得很不方便。改用模块化检测方法后，只需要1种核酸提取试剂和2种扩增试剂，加上各检测项目专用的引物探针，即可开展多个项目的检测。

6.2 适用性有待进一步验证

尽管在构建新方法时，对适用性进行了尽可能多的验证，如对于动物A型流感，就验证了H5亚型Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8、Re-10、Re-11、Re-12，以及H7亚型、H7N9、H7N9Re-1、H7N9Re-2等毒株的抗原，均证实有效。但对于其他毒株，尤其是较新型的变异株是否有效，尚有待进一步观察和验证。

6.3 关于质控品

质控品在某个检测方法中，起到非常重要的作用。E-出现阳性结果可能是核酸提取过程中受到污染，E+出现阴性结果可能是核酸提取试剂失效或提取过程出现问题，R-出现阳性结果可能是核酸扩增试剂受到污染，R+出现阴性结果可能是核酸扩增试剂失效。根据E-/E+/R-/R+的扩增结果，大致可以判断核酸提取和核酸扩增过程是否出现问题。阴性对照一般可用灭菌水代替，阳性对照可选用扩增效果较好的抗原或疫苗。

6.4 规范操作避免污染

由于阳性对照使用的是全病毒抗原或疫苗，一旦造成实验室内部环境污染，更换引物探针等方法无法有效消除污染。因此在实验操作各环节均要严格规范，阳性对照要事先经过可靠灭活，并尽可能降低其使用浓度，扩增产物、实验废弃物需进行无害化处理，以避免引起实验室内部环境污染和其他生物安全事故。

6.5 严格依法依规操作

农业农村部于2020年8月27日发布《关于非洲猪瘟病毒诊断制品生产经营使用有关事宜的通知》（农办牧〔2020〕42号），要求：自2021年1月1日起，各有关部门和单位在动物检疫或疫病监测、诊断中，对生猪及其产品开展非洲猪瘟病毒检测，应当使用已取得我部核发的产品批准文号的非洲猪瘟病毒诊断制品，确保检测结果准确。

按照此规定，实验室自行构建的非洲猪瘟检测方法将不能继续使用，必须改用获得兽药批准文号的商品化非洲猪瘟检测试剂盒。