主题：【分享】PCR技术在食品检测领域的最新应用进展

2　PCR技术在检测食品中有害微生物的应用

2.1　检测食品中的沙门氏菌

　　沙门氏菌病是公共卫生学上有重要意义的人畜共患病之一，病原属肠杆菌科，蛋、家畜和肉制品等都是主要的传播媒介。1993年Song等人利用PCR技术成功的检测到血液中的伤寒沙门氏菌DNA。1994年卢强等参考Rahn设计的引物，扩增了invA基因284bp的特异片段。

　　近年来，用PCR技术检测沙门氏菌得到了迅速发展，产生了许多种PCR法，如常规PCR、套式PCR、多重PCR。也可几种方法结合使用，如李君文等将常规PCR与半套式PCR相结合，根据沙门氏菌中保守的165rRNA基因为模板设计了一对引物，扩增的片段为555bp。经过优化设计反应条件，只对沙门氏菌产生特异性扩增，敏感性达30cfu。为了对扩增强果进行鉴定，又在这两条引物之间设计一条半套式引物。经半套式PCR检测下明第一次的产物是正确的，且灵敏度提高至3cfu。此外，还可将PCR与微孔板检测、ELISA技术以及探针杂交有机结合起来。

2.2　检测食品中的大肠杆菌

　　在大肠杆菌检测中，主要的检测目标是肠出血性大肠杆菌和肠毒素大肠杆菌两种。肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC)是指能够引起人类出血性肠炎的一类大肠杆菌，主要经口传播。该菌引起的食物中毒首先在美国于1982年爆发，之后在世界各地相继发现病例。卢林耿等在2001年进行的调查表明，我国的食品中也存在散发E.Coli0157的菌株。

　　王静等经过研究建立了一种快速检测食品中肠出血性大肠杆菌(EHEC)的多重PCR方法，将样品增菌后，采用快速裂解吸附法制备模板，用多重PCR同时检测EHEC的3种毒力基因eaeA、hlyAB、slt1/2，相应扩增片段依次为1109、302、228bp。检测了60株大肠杆菌和其它菌种：结果12株大肠杆菌0157：H7、1株大肠杆菌026：H11和1株大肠杆菌0111：H8，同进检出上述3种基因，2株EAEC检出了eaeA基因，1株VTEC检出了s1t1/2基因，其余43株大肠杆菌和非大肠杆菌未检出上述基因。检测食品中EHEC时，从样品增菌培养到整个检测过程结束不超过8小时，方法的检出限≤1.6 cfu/g(mL)。检测的126份食品样品中，3份检出了EHEC(包括牛肉、猪肉和生菜各1份)。试验结果表明，该法是一种特异性强、敏感性高、省时、省力的EHEC检测方法。

　　肠毒素大肠杆菌(ETEC)是引起婴幼儿腹泻的主要原因，也是导致“旅行者”腹泻的重要原因。王嘉福等(1997)用自己设计的两对引物，对食品中的大肠杆菌(ETEC)的热敏性毒素(LT)基因和耐热性毒素(ST)基因进行了PCR扩增，扩增出来的314bp和237bp DNA片段均能与相应的基因探针杂交，可以检测出3种毒素基因型(LT、ST及LTST)的ETEC，具有快速和灵敏度高的特点。

2.3　检测肉毒梭状芽孢杆菌

　　肉毒梭状芽孢杆菌产生的肉毒神经毒素，在天然物质中毒力最强。据报道，Nooki根据毒素A基因的非重复区段设计了两对特异性引物(NK1－NK2和NK3－NK2)分别用于扩增长度为546bp和252bp的特异片段；又根据毒素A基因的重复区段序列，设计了另外一对引物NK11－NK9，用于扩增长度为1266bp的特异片段。此三对引物都能快速、特异地从肉食品样品中检测出肉毒梭状芽孢杆菌。

2.4　检测金黄色葡萄球菌

　　金黄色葡萄球菌肠毒素(SE)可引起人类食物中毒，其内毒素——中毒休克综合症毒素(TssT1)可引起中毒休克综合症，产生的脱皮毒素(ETA、ETB)与一系列脓疤性葡萄球菌感染有关。Johenson等(1990)建立了检测上述毒素基因的PCR技术，可在较短的时间内检测出葡萄球菌毒株，并且具有极高的特异性和敏感性。

2.5　检测单核细胞增多症李斯特氏杆菌

　　李斯特氏杆菌广泛存在于自然界当中，是影响食品卫生的重要病原菌。有资料显示，在其传播途径中，动物性食品为主要传染源。研究资料表明，李斯特氏杆菌的致病性由2个重要致病因素引起：李氏溶血素O和侵袭因子内化素，无李氏溶血素O的李氏杆菌不致病。王芳等采用ERIC－PCR方法，根据是否可以扩增获得1600bp的DNA片段，作为鉴定单增李氏菌依据，并与国标鉴定方法进行对比，以确定ERIC－PCR方法的可靠性。试验结果表明，两种鉴定方法获得的结果完全一致，这证明ERIC－PCR方法鉴定单增李氏菌具有可行性。

3　PCR技术在检测食品中转基因成分的应用

　　目前植物性转基因食品的检测采用的技术路线有两条：一是检测插入的外源基因，主要应用PCR法、Northern杂交及Southern杂交；二是检测表达的重组蛋白，主要采用ELISA法、Western杂交及生物学活性检测。PCR技术应用于转基因产品的检测，其敏感快速、简便的特点是其它检测技术所无法比拟的。

　　刘光明等根据转基因农作物中常用的花椰菜叶病毒启动子(CaMV 35S)和根癌农杆菌终止子(NOS)的序列，设计并合成了两对不同的引物和相对应的两种荧光双链探针(FDCP)，分别建立了常规PCR、应用FDCP的新型实时荧光PCR检测转基因成分35S启动子和NOS终止子的方法。试验结果表明，两种PCR方法均能有效检测出35S和NOS片段，其中常规PCR方法具有灵敏度高、特异性好的特点；应用FDCP的新型实时荧光PCR方法则更为简便、快速、准确。

　　曹际娟等应用PCR技术对转基因(GM)玉米及其粗加工食品如：爆玉米花、热玉米棒、速溶玉米片中通常转入的基因构建元件35S启动子、NOS终止子和外源抗虫GryLA(b)目的基因进行检测；对GM玉米的检测低限可达到0.1％。

4　PCR技术在食品检测领域的应用展望

　　PCR技术在食品检测的实际应用中表现出灵敏度高、速度快、特异性强、简便、高效等特点，为食品检测技术的发展提供了有力的技术支持。但是，PCR技术在实际应用中也表现出一些缺陷，例如容易出现假阳性、假阴性，产物容易突变，不能检测致毒微生物产生的毒素等。

随着生物技术的飞速发展和各项新技术与PCR技术的有机结合，以及今后专门针对如何控制外源DNA的污染、如何控制突变和如何利用PCR技术鉴别致毒微生物产生的毒素等方面的深入研究，必将为PCR技术在食品检测领域更加广泛的应用提供新的思路。