动物A型流感荧光定量PCR检测方法的模块化构建及实践

1 前言

流感病毒（influenza virus）属正粘病毒科，根据抗原特性及其基因特性的不同，流感病毒分为甲型（A型）、乙型（B型）、丙型（C型）。乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定，仅感染人类；甲型（A型）抗原变异性最强，感染人类和其他动物，常引起世界性大流行。甲型流感病毒中至今发现能直接感染人的禽流感病毒亚型有：甲型H1N1、H5N1、H7N1、H7N2、H7N3、H7N7、H7N9、H9N2和H10N8。其中H1、H5、H7亚型为高致病性，H1N1、H5N1、H7N9尤为值得关注。

甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为18个亚型（H1～H18），N有11个亚型（N1～N11）。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。一般情况下，禽流感病毒不会感染鸟类和猪以外的动物。但1997年香港首次报道发生18例H5N1人禽流感感染病例，其中6例死亡，引起全球广泛关注。1997年以后，世界上又先后几次发生了禽流感病毒感染人的事件。具有高致病性的H5N1、H7N7、H7N9、H9N2等禽流感病毒，一旦发生变异而具有人与人的传播能力，会导致人间禽流感流行，预示着禽流感病毒对人类已具有很大的潜在威胁。

为确保公共卫生安全，以及畜牧业健康发展，有必要实施A型动物流感核酸监测，尽早发现疫情隐患并予以及时处置，避免重大动物疫情及公共卫生安全事件发生。

2 模块化检测方法思路

总体思路是：将动物疫病荧光定量PCR检测分为三个模块，核酸提取采用DNA/RNA共提试剂，核酸扩增采用预混液+引物探针方式，质控品利用抗原或商品化疫苗自制。具体思路如下：

——核酸提取采用DNA/RNA共提试剂；

——引物探针严格按照标准方法，委托生物工程公司合成；

——反应体系中其他成分，采购商品化RT-qPCR预混液（含逆转录酶）；

——质控品：阳性对照采用病毒抗原、商品化疫苗等，测定结果后按一定比例稀释，保存备用。

——反应体系：设为20μL，其中包含：预混液（2×）10μL、逆转录酶1μL、ROX 0.4μL为固定量，引物探针加入量根据检测标准中的终浓度予以换算，加灭菌水补足18μL，DNA或RNA模板为2μL；

——反应条件首先按照标准中的条件开展摸索，如达到预期效果则予以固定；如效果不佳则参照预混液及引物探针推荐条件进行适当调整。

3 材料和方法

3.1 病毒

禽流感血凝抑制抗原，包括H5亚型Re-4、Re-6、Re-7、Re-8、Re-11、Re-12等毒株，以及H7、H7N9、H7N9Re-2等毒株。

3.2 试剂

DNA/RNA共提试剂盒：FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit试剂盒，南京诺维赞生产；

RT-qPCR预混液：2× One Step Q Probe Mix，南京诺维赞生产；

逆转录酶：One Step Q Probe Enzyme Mix，南京诺维赞生产。

3.3 引物探针

按照GB/T27539-2011《动物流感检测 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》提供的序列，委托上海生工合成，引物稀释成10μmol/L、探针稀释成5μmol/L，分装成小包装冷冻保存备用。具体序列如下；

正向引物：5’-GTC TTC TAA CCG AGG TCG AAA C-3’

反向引物：5’-AAG ATC TGT GTT CTT TCC Tgc AAA-3’

探针：5’-FAM-CCC TCA AAG CCG AGA TCG C-TAMRA-3’

3.4 反应体系

根据GB/T27539-2011所载反应体系，按照终浓度一致原则予以转化。具体转换方法：

——反应体系总体积设定为20μL；

——将标准中反应体系的10×PCR Buffer、Mgcl2、dNTPs、Taq酶、反转录酶等成分转换为RT-qPCR预混液10μL、逆转录酶1μL（推荐量）；

——因使用ABI7500荧光PCR仪，故在体系中加入ROX 0.4μL；

——标准中正向引物、反向引物、探针的终浓度分别为0.2μmol/L、0.2μmol/L和0.16μmol/L，故在修改后的体系中加入量为0.4μL、0.4μL和0.64μL；

——总RNA加入量修改为2μL（根据经验该加入量已经足够）；

——根据上述各成分用量，补充体积的无核酸酶水修改为5.16μL。

GB/T27539-2011		修改方法
10× PCR Buffer	1.25	2× RT-qPCR预混液	10
正向引物（10μmol/L）	0.5	酶混合液	1
反向引物（10μmol/L）	0.5	ROX	0.4
探针（5μmol/L）	0.8	正向引物（10μmol/L）	0.4
Mgcl2	0.75	反向引物（10μmol/L）	0.4
dNTPs	0.1	探针（5μmol/L）	0.64
Taq酶（5U/μL）	0.25	总RNA	2
反转录酶	0.25	无核酸酶水	5.16
无核酸酶水	10.6	总体积	20
总RNA	10
总体积	25

3.5 反应条件

参照GB/T27539-2011推荐的扩增程序，结合ABI7500荧光采集时间不能少于34s的要求，进行预试验。扩增程序如下：

42℃30min→92℃3min→(92℃10s→45℃30s→72℃1min)*5→(92℃10s→60℃34s)*40

如扩增结果理想，则不做修改直接采纳，否则进行适当调整。

4 试验结果

对禽流感病毒包括H5亚型Re-4、Re-6、Re-7、Re-8、Re-11、Re-12等毒株，以及H7、H7N9、H7N9Re-2等毒株均进行了核酸检测，结果均较理想。部分扩增曲线如下：

H5亚型Re-8抗原扩增曲线

H5亚型Re-11抗原扩增曲线

H5亚型Re-12抗原扩增曲线

H7N9抗原扩增曲线

H7N9 Re-2抗原扩增曲线

5 阳性质控的制备

根据GB/T 27539-2011 《动物流感检测 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》规定，阳性对照应Ct<28。结合各抗原扩增情况，挑选了H5亚型Re-8、Re-11、Re-12三种抗原适当稀释后进行再次检测，结果如下：

稀释倍数	1:10^3	1:10^4	1:10^5	1:10^6
H5Re-8抗原	16.81	22.18	25.39	28.97
H5Re-11抗原	15.75	20.79	24.82	28.31
H5Re-12抗原	14.75	19.72	22.90	26.8

经综合判定，最后采用H5亚型Re-11抗原作1: 10^5稀释，分装为200μL/管作为阳性质控，Ct值约25，-70℃冻存备用。

6 讨论

6.1 检测工作更加方便高效

一是在核酸提取环节采用了DNA/RNA共提试剂，待检样品经一次提取核酸，除可应用于A型流感等RNA病毒项目检测外，还可应用于非洲猪瘟、圆环病毒等DNA病毒项目检测；

二是由于实验室储备了足够量的qRT-PCR预混液及逆转录酶，在开展检测时，不必担心部分检测量较少的项目由于试剂组分不足而罢工事件的发生；

三是由于qRT-PCR预混液及逆转录酶适用于多数RNA病毒项目的检测，在检测任务发生重大变化时，可以方便地调整检测项目，不必担心试剂不足或浪费情况的发生；

6.2 阳性质控品制备方便

动物疫病监测实验室常备禽流感血凝抑制抗原，并可根据病毒变异情况及时更新。只需对贮存的抗原进行含量测定，取合适的抗原进行一定比例的稀释即可作为实验室内部的阳性质控品。

6.3 适用性有待进一步验证

尽管在构建新方法时，对适用性进行了尽可能多的验证，但对于其他毒株，尤其是较新型的变异株是否有效，尚有待进一步观察和验证。

6.4 严格依法依规操作

如果有关法律法规或上级有关部门出台政策，要求采用获批准的成品试剂盒用于检测，则实验室必须及时停止自建方法的使用。