流化床混合过程NIRS在线监测API含量的可行性研究

在流化床混合过程中，腔室内粉末共混物中API含量的瞬态干扰检测是一个重要的研究课题。然而，在实际生产中流化床混合过程具有不可见性，流化床腔室中物料的化学和物理性质的真实状态无从知晓。所以使用PAT技术监测混合过程API含量均匀性的价值不言而喻。为了实现流化床混合过程的可视化，本章在实验模拟型流化床上将过程分析技术NIRS引入到流化床混合过程中，对过程关键质量属性—API含量进行定量监测。

目前，批次混合过程中的一种常见建模方法是使用多个批次的样本建立校准模型，但在生产条件下要收集具有代表性的校准集需要消耗大量的物料，否则会影响后续模型的稳健性。本课题提出在小试实验型流化床中使用有限的原辅料建立校准光谱模型，用于监测流化床混合过程中API的含量。最后，研究了光谱预处理和波段选择方法，建立PLS模型来预测API含量。结果表明，在有效的光谱预处理和波段选择方法的帮助下，近红外传感器可以准确地测定混合物中API的含量，从光谱监测的角度证明了NIRS用于流化床混合过程API含量均匀性检测的可行性。同时，增加了对工艺过程的了解，从而科学有效地控制生产过程，提高产品质量，保证产品安全。

试剂

对乙酰氨基酚（山东昌达生物科技有限公司）；微晶纤维素（安徽山河药用辅料股份有限公司）；玉米淀粉（山东聊城华阳医药辅料有限公司；北京闵松经贸有限公司）；一水合乳糖（镇江市康富生物工程有限公司）；氢氧化钠（上海艾览化工科技有限公司）；羟丙基甲基纤维素（安徽山河药用辅料股份有限公司）；去离子水。

仪器和软件

LGL 002实验型流化床（山东新马制药装备有限公司）；Micro NIR PAT-U 微型近红外光谱仪（美国Viavi Solutions公司）；紫外分光光度计；烘箱；分析天平；干燥器；Matlab 2016b（美国Mathworks公司）；Unscrambler X 10.4 (挪威 CAMO 公司)；orign85（美国OriginLab公司）。

实验设计

实验设计(Calibration Design of Experiments, DOE)的目的是将流化床混合过程中监测腔室内API含量变化时遇到的最常见的原辅料变异性来源[48]（包括原辅料的粒径，密度，杂质含量等）尽可能包含进去。采用超饱和设计挑选出影响API含量变化的活跃因子，然后再通过近似正交[49, 50]阵列来设计校正集批次和校正集范围，目的是保持一个相对较少的实验批次，同时引入尽可能多的原料和辅料的可变性。选择特定的因子组合，使成对的因子得到尽可能多的平衡（优先考虑API理论含量和API批次因子）。对于连续因子，选择因子水平的分配来减少与API理论含量因子的相关性，同时限制与其他连续因子的相关性。总共设计了7种校正集批次，用于生成校正数据集。具体的实验设计见下表：

校正集批次实验设计

实验批次	API理论含量(%)	API批次	辅料1/辅料2	物料粉末粒径
1	90	190437	10：10	未过筛
2	100	190438	11：10	未过筛
3	100	190438	10：10	过80目筛
4	110	190439	10：10	过80 目筛
5	80	190439	11：10	过100目筛
6	80	190437	9：10	未过筛
7	90	190438	9：10	过100目筛

对于材料的可变性，原料药和辅料都被考虑在内。三种不同的API批次（表中批次190437-9），提供了具有代表性的API粒度和密度范围。四种不同的API理论含量（80、90、100、110%），提供了一个合适的含量范围。辅料1和辅料2是同一辅料的不同级别（淀粉），通过改变两个级别之间的比值来模拟淀粉批次和杂质含量的变异性，其中包括粒度可变性和密度可变性以及杂质含量可变性。将7个批次的配方混合物进行筛选并重新组合，以创建粒径大小的可变性。其余两种辅料在混合过程配料时保持恒定的相对比例。由于本研究考察的CQA为API含量，为避免高含量批次（批次4，API含量为110%）样品较少带来的杠杆效应，故增加批次8，批次8配方与批次4完全相同。批次1-8每个批次在不同工艺及环境参数下各进行8次实验，校正集共包括64个混合批次。

混合过程

本部分实验所有混合批次均在实验模拟型流化床（LGL 002）中进行，每个混合批次API和辅料的总重为2000 g。本研究所采用的标准配方如下：对乙酰氨基酚（API, 400 g, 20%w/w)，微晶纤维素（620 g, 31%w/w），玉米淀粉（440 g, 22%w/w），乳糖（490 g, 24.5% w/w），羟丙基甲基纤维素（50 g, 2.5% w/w）。

每个混合批次的具体实验过程为：首先预热流化床设备15 min，预热至相应的设定点温度（50 ℃或70 ℃）左右，放入按配方及比例称好的物料，进行混合。混合时间约为15 min，其中包括预混合5 min，混合10 min。

光谱采集

每个批次混合过程中，在取样口进行一次取样，取得的样品用于静态原始光谱的采集和一级数据的测定，静态原始光谱由Micro NIR PAT-U 微型便携式近红外光谱仪（美国Viavi Solutions公司）采集。该光谱仪采用线性渐变滤光片(Linear Variable Filter, LVF)分光技术，检测器为阵列检测。具有体积小质量轻，无移动部件，USB供电，USB数据传输，无需外接光纤，性价比高，适用性广等特点，这些特点有利于该光谱仪在工业生产中对药品关键质量属性监测的应用。

模型的建立与评价

本章节中采用软件Matlab 2016b（美国Mathworks公司）和Unscrambler X 10.4 (挪威 CAMO公司) 对流化床混合过程采集的原始光谱进行处理。首先，对采集到的原始光谱进行平均从而使光谱与一级数据（API含量）一一对应。然后，利用主成分分析(Principal Component Analysis, PCA)识别出光谱中的异常值。下一步研究了不同的预处理方法，以消除无关信息的干扰。为了进一步提高模型的预测能力，比较了相关系数法(Correlation Coefficient, CC)、无信息变量消除算法(Uninformative Variable Elimination, UVE)[51, 52]、VIP算法(Variable importance plot, VIP)和吸光度-浓度变化率方法 (Ratio of Absorbance to Concentration, RATC)四种不同的波段选择方法的处理结果。通过校正均方根误差(RMSEC)、交互验证均方根误差(RMSECV)、校正集决定系数(R2c)和交叉验证决定系数(R2cv)对校正集模型进行了评价。最后，通过32个外部独立验证集样本，利用预测均方根误差(RMSEP)验证了模型的预测能力，以探索NIRS用于流化床混合过程API含量在线监测的可行性。本节所使用的公式如下:

主成分分析

主成分分析(PCA)是一种经典的离群点检测方法，它通过选择相关的临界极限和推导置信椭圆来实现[57, 58]。在PCA得分图中，样品点之间的位置越近，它们的光谱越相似。一般情况下，根据PCA得分图，如果样本点的位置在置信区间（一般为95%）之外，则该样品被认为是异常样本。PCA能够成功地从校准集中去除某些异常的样本，去除异常值可以避免预测值的明显偏差，提高模型的准确性和稳定性。在本研究中，使用PCA方法检测异常值，图为基于前两个潜在变量(Latent Variable, LV)的PCA得分图。根据PCA得分图，校正集样品中无异常点，因为它们都位于置信椭圆(95%)之内。从得分图可以看出，第一主成分捕获了92.74%的变异性，第二主成分捕获了1.89%的变异性，第一主成分主要解释了大部分API浓度的变异性。与此同时，各个集群中样品点不同程度的离散，源于DOE中不同因子的多个水平的差异，包括API批次、辅料1和辅料2之间的不同比例以及混合物粒径的差异等。广泛的原辅料材料特性被包含在校正集中，改进了模型对未来预测集中原辅料材料变异的稳定性。

流化床混合样品PCA得分图

光谱预处理

为了减少或消除光散射效应、测量角度、测量距离以及背景干扰带来的基线漂移和其他不规则的系统噪音[59, 60]，本研究采用了均值中心(meancenter)、标准正态变换(Standard Normal Variate Transformation, SNV)、导数、Savitzky-Golay (SG)平滑等几种不同的预处理组合对校正集平均光谱进行了预处理。导数在提高分辨率的同时会产生噪音，因此对求导后的光谱进行了平滑。用SNV来消除由于粉末粒径，密度，近红外测量角度、距离的差异带来的影响。然后，建立PLS模型对预处理结果进行评价。在此过程中，使用留一交叉验证(Leaving one out cross validation, LOOCV)来选择潜在变量。模型参数如表所示。

不同预处理方法建模参数结果

序号	预处理	RMSEC	RMSECV	R2c	R2cv	R2p	RMSEP	LVs
1	Raw	2.2818	2.6997	0.999	0.999	0.963	2.1505	5
2	meancenter	2.06	2.4013	0.966	0.955	0.974	1.7872	4
3	SNV+meancenter	1.8904	2.2385	0.971	0.961	0.977	1.6820	3
4	SNV+FD+SG3+meancenter	1.9935	2.5769	0.968	0.948	0.96	2.2361	3
5	SNV+FD+SG5+meancenter	2.0804	2.482	0.965	0.951	0.973	1.8323	3
6	SNV+SD+SG3+meancenter	1.5014	2.7914	0.982	0.943	0.969	1.9649	3
7	SNV+SD+SG5+meancenter	1.4554	3.0357	0.983	0.929	0.965	2.1046	5
8	FD+SG3+meancenter	1.4062	2.3337	0.984	0.958	0.977	1.6801	5
9	FD+SG3+SNV+meancenter	2.0054	2.518	0.968	0.95	0.971	1.8893	3
10	FD+SG5+meancenter	1.6643	2.0198	0.978	0.969	0.976	1.7176	4
11	FD+SG5+SNV+meancenter	2.0773	2.4021	0.965	0.955	0.973	1.8349	3
12	SD+SG3+meancenter	1.5572	2.8779	0.981	0.935	0.964	2.125	3
13	SD+SG3+SNV+meancenter	1.5092	2.8393	0.982	0.936	0.965	2.0787	3
14	SD+SG5+meancenter	1.4253	2.9659	0.984	0.931	0.969	1.9811	5
15	SD+SG5+SNV+meancenter	1.4883	3.0722	0.982	0.927	0.965	2.0912	5

研究了15种预处理组合的结果，不同的预处理甚至不同预处理方法的使用顺序都会对结果产生影响。以模型的RMSECV和RMSEP为评价指标，为不同预处理后的建模结果比较。从图中可以看出，每一个组合都产生了可接受的结果，达到了预测的目的。经SNV和均值中心化预处理组合处理后的建模结果具有最佳的预测能力，图为具体的模型图，RMSEC、RMSECV、R2c、R2cv、R2p、RMSEP值分别为1.8904%、2.2385%、0.971、0.961、0.977、1.6820%。

图为SNV预处理后的平均光谱图，预处理后，近红外光谱基线较图明显变得平稳，可能是由于消除了光谱采集时粒径，密度，测量密度，测量角度带来的光散射效应。在1100 nm、1500 nm和1600 nm三处变化明显的波段，光谱的吸光度与API理论含量成正比关系。这些波段与API特征峰（波峰或者波谷）相对应，证明了近红外光谱对API含量响应的特异性。

不同预处理后的建模结果比较

SNV预处理后的平均光谱图

由于第一主成分捕获了大部分API含量的变异性，图2-8(b)为最佳预处理后PLS模型的第一主成分荷载图、纯API和主要辅料的光谱图比较。通过比较，可以清楚地看到，第一个主成分荷载图与API的纯组分光谱(特别是在1100 nm、1500 nm、1600 nm左右)有相同的趋势，证明了PLS模型能够捕获与API含量相关的变化，证明了PLS模型对API含量的特异选择性。

(a)

(b)

(a)最佳预处理后PLS模型的第一主成分荷载图；(b)纯API和主要辅料的光谱图比较

PLS模型的评价及验证

利用外部数据集(28个样本)对建立的PLS模型（图2-13a）进行验证，结果如图所示。R2p、RMSEP分别为0.981和1.5296%，模型具有较好的预测效果。图2-14 (a)为校正集和验证集样品PCA得分图，(b)为诊断图。从图中可以看出，验证集大部分样本点都位于校正集样本点所在范围内，这表明验证集中所表现出的与API含量相关的变化被包含在了校正集中。进一步对近红外预测数据和参考值进行方法学考察，近红外测量具有良好的准确度(RMSEP=1.5296%)、精密度(100%含量下的SD=2.2%)和线性度(R=0.921)，说明了近红外光谱法监测API含量的可行性。


(a)	(b)
图2-13 (a)经最佳预处理和波段选择优化后的PLS模型图；(b) API含量模型验证图


(a)	(b)
(a)校正集和验证集样品PCA得分图；(b)诊断图（图中蓝色虚线表示95%的置信区间）

小结

采用一种新型的便携近红外传感器，验证了其对流化床混合过程API含量过程监测的可行性。通过研究不同的预处理和波段选择方法提高了模型的预测能力，R2、R2cv、RMSEC、RMSECV、R2p和RMSEP分别为0.977、0.973、1.6776、1.8588、0.981和1.5296。对该方法进行方法学考察，结果表明近红外测量具有良好的准确度(RMSEP=1.5296%)、精密度(100%含量下的SD=2.2%)和线性度R=0.921)。再次说明了近红外光谱法监测API含量的可行性。本研究可作为中试和工业流化床混合过程中便携近红外传感器在线监测的参考，本研究表明近红外光谱法有可能取代传统的测量方法，实现实时监测混合过程。并可将CQA与关键工艺参数相连接，实现固体制剂的智能化生产。下一步研究中，将进行近红外在线定量模型分析建立和研究。

附件：

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