主题：【原创】新生儿遗传疾病筛查串联质谱法中污染物的另类解决方案探究

随着串联质谱的不断普及，越来越多的行业领域开始运用的串联质谱作为检测手段，在临床上运用串联质谱检测的项目也不少，例如维生素D，胆汁酸，新生儿遗传疾病筛查等等。新生儿遗传疾病筛查是利用串联质谱技术检测新生儿足根血干血斑中12种氨基酸和31种酰基肉碱的含量，而在该方法中，加上相应的12个氨基酸的内标和13个酰基肉碱内标，一共有68对离子对，一旦在样本处理过程或者在仪器里残留着跟我们的目标化合物离子对相近的污染物的话，那必然会对分析结果产生影响，此文章主要是研究如何在未能找到污染源的情况下把干扰离子的影响降到最低。

1 案例一

在本案例中，怀疑某厂家质控品有两个干扰物，离子对分别是255.3/85和375.4/85，这两个干扰物正好跟新生儿遗传疾病筛查指标里面的C5 IS和C14 IS 离子对一样，所以会对C5和C14的结果产生影响。本次研究主要分两部分实验，实验一完全按照新生儿遗传疾病筛查串联质谱法的正常实验流程，唯一改变的是在质谱条件上，使用不同的cone voltage，研究不同的cone voltage 对C5和C14的最终结果有何不同。实验二，在实验一的基础上加入色谱柱（新生儿遗传疾病筛查串联质谱法是不使用色谱柱的），研究在255.3/85和375.4/85两个通道上是否有干扰物分离出。

1.1 实验一

1.1.1主要仪器

美国Waters公司的UPLC I-class XevoTQD串联质谱系统。

1.1.2主要试剂

美国Perkinelmer公司NeoBase试剂盒；2020年美国CDC QC质控；2020年国家卫生健康委临床检验中心第一次全国室间质量评价质控；台湾CIR质控；甲醇：色谱纯，Merck产品；屈臣氏纯净水。

1.1.3样本处理

按照美国PerkinElmer公司NeoBase试剂盒的方法处理样本以及另外三方的质控，处理完成后上机待测。

1.1.4色谱条件

色谱柱：无；流动相A：采用PerkinElmer公司NeoBase试剂盒配套的流动相；流动相B：无；梯度程序为：0~0.15min（0.16mL/min），0.16~1.10min（0.015mL/min），1.11~1.30min（0.70mL/min），1.31~1.60min（0.16mL/min）；进样量20微升。

1.1.5质谱条件

电喷雾电离（ESI），正离子模式，Capillary 3.5kV，Source Temp 120℃，Desolvation Temp 350℃，Desolvation gas 600L/hr，Cone gas 50L/hr，68对离子对，采用MRM模式扫描。

1.1.6结果与分析

本次实验一共处理了8个样本，分别是3个正常新生儿样本，2个浓度NeoBase试剂盒质控以及台湾CIR质控，2020年美国CDC QC质控，2020年国家卫生健康委临床检验中心第一次全国室间质量评价质控各一个。

                                表1 不同cone voltage C5的结果分析

	Cone Voltage(V)	16	21	26	31	36
C5 (μmol/L)	厂家A质控	5.28	4.8	3.54	2.62	1.5
	厂家B质控	1.29	1.23	1.25	1.21	1.21
	厂家C质控	2.41	2.29	2.26	2.34	2.22
	试剂盒质控1	1.25	1.19	1.16	1.12	1.05
	试剂盒质控2	3.48	3.39	3.15	3.22	3.26
	样本1	0.14	0.12	0.1	0.07	0.08
	样本2	0.07	0.07	0.09	0.08	0.08
	样本3	0.08	0.06	0.05	0.06	0.07

                                                            表2 不同cone voltage C14的结果分析

	Collision Energy(V)	25	30	35	40	45
C14      (μmol/L)	厂家A质控	3	4.1	5.48	6.12	6.8
	厂家B质控	1.39	1.39	1.4	1.38	1.36
	厂家C质控	2.53	2.49	2.48	2.49	2.49
	试剂盒质控1	2.18	2.05	2.17	2.19	2.17
	试剂盒质控2	5.75	5.96	6.09	5.96	6.35
	样本1	0.13	0.13	0.15	0.15	0.16
	样本2	0.32	0.31	0.32	0.3	0.31
	样本3	0.05	0.06	0.05	0.06	0.05

由表1和表2结果可见，只有厂家A质控的结果是随着cone voltage的改变而改变，正常的情况cone voltage改变是不会影响结果浓度的，怀疑厂家A质控内存在污染物干扰离子，下面进行实验二。

1.2 实验二

1.2.1主要仪器

跟实验一相同。

1.2.2主要试剂

跟实验一相同。

1.2.3样本处理

跟实验一相同。

1.2.4色谱条件

色谱柱：Waters ACQUITY UPLC C18 色谱柱（2.1mm X 50mm，1.8μm）；流动相A：去离子水；流动相B：甲醇；梯度程序为：0~1min（90%A），1~4min（90%~10%A），4~7（10%A），7~8min（10%~90%A）；柱温35℃；流速0.3mL/min；进样量20微升。

1.2.5质谱条件

      跟实验一相同

1.2.6结果与分析

    在通道255.3/85中，厂家A质控在2.30min和5.75-5.90min处各有一个色谱峰，其他的样本都只有在2.30min处有一个色谱峰；在通道375.3/85中，厂家A质控在0.55min和5.23min处各有一个色谱峰，而其他的样本都只有在5.23min处有一个色谱峰，这说明厂家A质控在通道255.3/85和375.3/85处有干扰物。

    下面我们再验证不同的cone voltage对厂家A质控上C5 IS，C14 IS目标物和干扰物有何影响。

                                                                                  图1 不同cone voltage下C5 IS和干扰物的色谱峰



                                                                                图2 不同cone voltage下C14 IS和干扰物的色谱峰



由图1和图2可以看出，采用不同的cone voltage，C5 IS C14 IS目标物和干扰物响应值变化的百分比都不同。如表3，在cone voltage取21时，这时候干扰物的响应值是最低的，干扰物/C5 IS 是3.92%，当cone voltage取36时，干扰物/C5IS 却升到了87.56%。在新生儿遗传代谢病筛查串联质谱法中是不使用色谱柱的，一旦出现相同离子的干扰物，必然会对该物质造成影响，所以遇到这种干扰物，我们是否可以取一个合理的cone voltage值，在目标物响应值不能过低的前提下，降低干扰物的的响应值从而降低对目标物的影响呢。

                                                            表3 不同Cone voltage下C5 IS 和干扰物的响应值变化

Cone voltage (V)	C5 IS intensity (CPS)	干扰物intensity (CPS)	干扰物 /C5 IS （%)
21	18065	708	3.92
26	18023	2710	15.04
31	26794	7962	29.72
36	31984	28004	87.56

表4 不同Cone voltage下C14 IS 和干扰物的响应值变化

Cone voltage    (V)	C14 IS intensity (CPS)	干扰物intensity (CPS)	干扰物/C14 IS  （%)
35	93038	11325	12.17
40	86381	8146	9.43
45	80184	6059	7.56
50	75787	4446	5.87

2 案例二

案例一的干扰物是存在于样本里，而案例二的干扰物则是残留于仪器中，案例二的情况是离子通道135.1/89本底升高，而该干扰物一直残留在仪器当中无法清除，该干扰物正好跟LEU IS离子对一样，所以该通道本底升高必然会对LEU结果产生影响。本案例主要是研究优化cone voltage 和collision engergy来降低干扰物对目标物的影响。

2.1 主要仪器

美国ABsciex公司的API3200MD串联质谱系统。

2.2 主要试剂

高浓度美国Perkinelmer公司NeoBase试剂盒内标溶液（母液稀释50倍）；甲醇：色谱纯，Merck产品；屈臣氏纯净水

（注：该内标溶液和甲醇均在别的仪器上验证过没有135.1/89的干扰物存在）

2.3 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）；正离子模式扫描；电喷雾电压5500V；离子源温度350℃；GAS1 30；GAS2 35。

采用针泵连续进样，采集方式采用MRM模式，母离子135.1，子离子89.0，用ABsciex Analyst Software自带的ramping功能对DP voltage（相当于waters的cone voltage）和collision energy进行调试，每个项目ramping三次取平均值，研究不同的DP 和CE 对该干扰物和LEU IS的影响。

2.4 结果与分析

首先进样溶剂是纯甲醇，由于该干扰物一直残留在仪器当中，故用针泵进甲醇相当于采集到就是该干扰物，对DP和CE分别进行Ramping 优化。把针泵里的甲醇换成高浓度的内标溶液，同样进行DP和CE Ramping 优化。得到的结果如图3，图4.

                      图3 LEU IS和干扰物 DP Ramping对比



                      图4 LEU IS 和干扰物 CE Ramping对比




由图3可见，一般情况下，LEU IS DP电压的取值一般都是取响应值最高点，也就是40V，但是干扰物在这点也会有不低的响应值，干扰物在这样的电压下必然会对目标物造成影响，但是如果DP取50V或者55V，LEU IS的响应值虽然有所下降，但是干扰物的响应值下降的幅度会更大。同理如图4，当CE电压从14更改成22时，干扰物的响应值下降了接近10倍，而LEU IS 的响应值只下降了两倍，大大降低了干扰物对目标物的影响。

原创者：Jam