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摘要:试样经乙酸溶解,经过滤后制备成测试溶液。经紫外法预测试,蛋白浓度较低,选择考马斯亮蓝法(Braford
法)测定蛋白浓度。以BSA
溶液浓度绘制标准曲线,其线性相关系数达到0.99
以上。标定样品蛋白浓度时发现测量值超出标曲的有效计算范围。降低实验测试BSA
浓度和反应试剂体积,重新绘制微量蛋白浓度标准曲线,测定后可得蛋白浓度为 11.05μg/ml
,玉米秸秆中蛋白含量为0.221%
。关键词:蛋白质浓度;考马斯亮蓝法;玉米秸秆1 蛋白质浓度测定方法对比(1)
双缩脲法:双缩脲是在大约180°C
条件下加热两个尿素分子,以达到释放出一个氨分子而获得的产物。在强碱性溶液中,缩二脲和硫酸铜形成紫色络合物,称为缩二脲反应。当底物中含有肽键时(多肽),试液中的铜与多肽配位,配合物呈紫色。可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm
。(2) Folin
酚试剂法:Folin—
酚试剂中的磷钼酸盐—
磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基还原,产生深蓝色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,蓝色深度与蛋白的量成正相关。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多。(3)
紫外法:蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它们具有吸收紫外光的性质,其吸收高峰在280nm
波长处,且在此波长内吸收峰的光密度值与其浓度成正比关系,故可作为蛋白质定量测定的依据。(4)
考马斯亮蓝法:也称Bradford
检测法,考马斯亮蓝G-250
在游离状态下呈红色,最大光吸收在488nm
;当它与蛋白质结合后变为青色,蛋白质-
色素结合物在595nm
波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比,因此可用于蛋白质的定量测定。2 试剂和材料
2.1 试剂1
)BSA
粉末2
)乙酸3
)考马斯亮蓝试剂:(Thermo CoomassiePlus Assay Reagent
)2.2 仪器设备1) Amersham Biosciences Ultrospec 2100
pro2) 分析天平
3) 涡旋振荡器
4) 离心机
5) 石英比色皿
3 实验方法
3.1 配置样品溶液称取粉碎均匀的样品 25mg
至 15ml
离心管中,加入 1%
乙酸水溶液 5ml
,样品终浓度为 5mg/ml
,颠倒混匀至样品完全溶解。3.2 配置常规蛋白浓度标准品和样品称取BSA
粉末 2mg
左右至 2ml
离心管中,加入 1%
乙酸水溶液 1ml
,标准品母液终浓度为 2mg/ml
。用 1%
乙酸水将标准品分别稀释至表1
中标准蛋白浓度。3.3 测试用二次水做blank
。取200μl
考马斯亮蓝试剂与200μl
标准品/
样品混合,室温放置10
分钟,测定在595nm
波长吸收值。每个测试样品至少重复三次。3.4 配置微量蛋白浓度标准品称取BSA
粉末 2mg
左右至 2ml
离心管中,加入 1%
乙酸水溶液 1ml
,标准品母液终浓度为 2mg/ml
。用 1%
乙酸水将标准品分别稀释至表 2
中标准蛋白浓度。3.5 微量蛋白浓度测试用二次水做blank
。取750μl
考马斯亮蓝试剂与25μl
标准品/
样品混合,室温放置10
分钟,测定在595nm
波长吸收值。每个测试样品至少重复三次。4 结果
4.1 绘制标准曲线根据 125~1000 μg/ml OD595
绘制标准曲线,获得线性相关曲线如图 1
。线性相关方程为 y=0.0008x + 0.0522
,R2=0.9937
。[img=,415.15,219.75]file:///C:/Users/jiajia66/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image001.png[/img]
图1 常规浓度标准曲线
4.2 测定并计算蛋白浓度经过分析检测,标准品和样品与亮蓝
G-250试剂反应后
OD595nm吸收峰为如下:
表1 标准曲线测定
标准物(BSA)
浓度(μg/ml) | 0 | 25 | 125 | 250 | 500 | 750 | 1000 | 1500 | 2000 | 样品
(5mg/ml) |
OD(595nm) | 0.348 | 0.339 | 0.466 | 0.546 | 0.737 | 1.014 | 1.160 | 1.265 | 1.399 | 0.341 |
| 0.327 | 0.345 | 0.466 | 0.589 | 0.822 | 0.992 | 1.107 | 1.257 | 1.406 | 0.350 |
| 0.309 | 0.347 | 0.471 | 0.589 | 0.821 | 1.024 | 1.187 | 1.255 | 1.433 | 0.354 |
平均值 | 0.328 | 0.343667 | 0.467667 | 0.574667 | 0.793333 | 1.01 | 1.151333 | 1.259 | 1.412667 | 0.348333 |
扣除blank | | 0.015667 | 0.139667 | 0.246667 | 0.465333 | 0.682 | 0.823333 | 0.931 | 1.084667 | |
带入标准曲线由此计算可得样品中蛋白含量过低,超出标准曲线范围。因此采用微量浓度测定方法。
4.3 绘制微量蛋白浓度标准曲线根据 3~30 μg/mlOD595
绘制标准曲线,获得线性相关曲线如图 1
。线性相关方程为 y=0.0166x + 0.0845
,R2=0.9906
。[img=,393.4,205.15]file:///C:/Users/jiajia66/AppData/Local/Temp/msohtmlclip1/01/clip_image002.png[/img]
图2 微量浓度标准曲线
4.4测定并计算蛋白浓度由此计算可得样品中蛋白浓度为 11.05 μg/ml,蛋白含量为0.221%。
表2 微量蛋白浓度标准曲线测定
标准物(BSA)
浓度(μg/ml) | 0 | 3 | 6 | 12 | 24 | 30 | 样品
(5mg/ml) |
OD(595nm) | 0.256 | 0.365 | 0.43 | 0.561 | 0.744 | 0.828 | 0.521 |
| 0.245 | 0.371 | 0.44 | 0.557 | 0.744 | 0.811 | 0.526 |
| 0.253 | 0.361 | 0.44 | 0.564 | 0.747 | 0.816 | 0.511 |
平均值 | 0.251333 | 0.365667 | 0.436667 | 0.560667 | 0.745 | 0.818333 | 0.519333 |
扣除blank | | 0.114334 | 0.185334 | 0.309334 | 0.493667 | 0.567 | 0.268 |