摘要: 用超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱法(UPLC-MS/MS)检测农作物中的松柏醇（CA）、松脂醇（Pin）、落叶松脂素（Lar），色谱柱为Agilent SB C18 RRHD，检测柱温为40℃，初始流动相为乙腈∶水=4∶1，按5mM的量加乙酸铵，检测流速为0.3mL/min，其检出限分别为1.25~ 5. 10 μg/L，定量限分别为3. 75~ 15. 60 μg/L，满足农作物中CA、Pin和Lar同时检测的要求。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱；松柏醇；松脂醇；落叶松脂素；农作物

Determination of CA, Pin and Lar in crops based on LC-MS/MS

Yi Ying¹² ,Sun Yinglu¹²,Zhang Lina¹²

(1.Major Platform Center, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100089, China; 2. Scientific Instruments and Equipment Verification and Evaluation Center of China Instruments and Apparatus Society (Bioscience Station))

Abstract：Ultra-performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was used to detect CA, Pin and Lar in crops. The chromatographic column was Waters Acquity Agilent SB C18 RRHD, the temperature of the detection column was 40℃, the mobile phase consisted of acetonitrile:water =4:1, and 5mM ammonium acetate was added. The detection flow rate was 0.3 mL/min, the detection limits were 1.25-5.10 μg/L, and the quantification limits were 3.75-15.60 μg/L, respectively, which satisfied the requirements of simultaneous detection of T6P and Tre in crops.

Keywords: UPLC-MS/MS; CA; Pin; Lar; crops

1 引言

自1997年Lewis等首次提出DIR蛋白广泛存在于植物体内，参与并指导木脂素生物合成过程中位置的选择和立体选择，这类具有dirigent结构域的蛋白就引起了科学家的广泛关注。为了了解木脂素在不同农作物组织中含量的差异，我们通过HPLC-MS/MS平台对木脂素代谢途径中的母核化合物CA，Pin和Lar进行含量测定^[1,2]。

2 材料和方法

仪器与试剂：谱育EXPEC5210三重四极杆液相色谱联用仪（UPLC5210二元高压输液泵、自动进样器、柱温箱、质谱仪）、电子天平(BSA224S型，赛多利斯科学仪器有限公司产品),KQ-250E型超声波清洗器 (昆山禾创超声仪器有限公司产品)，PICO17型离心机(美国赛默飞公司产品)。

乙腈(色谱纯,美国赛默飞公司产品)，乙酸铵(纯度≥98％，德国CNW 公司产品)。 T6P和Tre购sigma-aldrich贸易有限公司，质谱用水为屈臣氏蒸馏水。

分析条件：色谱柱:Agilent SB C18 RRHD Column (100 mm×2.1 mm,1.8 μm)，柱温40 ℃，进样体积5 μl，流动相:A:乙腈 B:5 mM乙酸铵-水，流速0.3ml/min

0min 20A%

1 20A%

5 80A%

5.1 20A%

7 20A%

离子源:电喷雾离子源；扫描方式:负离子切换扫描；检测方式：质谱多反应监测(MRM)^[3]；优化的质谱条件见表1。

表1 Lar和CA、Pin的质谱多反应检测质谱参数

化合物母离子（m/z) 子离子（m/z) 锥孔电压碰撞能

Lar 359 329.1 50 10

CA 179.2 146、164 50 15

Pin 357 151、136.1 50 20

3 结果与分析

3.1线性范围与检出限

Agilent SB C18 RRHD色谱柱检测时，Lar的质量浓度为7.25 μg/L、14.5 μg/L、72.5 μg/L、145 μg/L、290 μg/L、725 μg/L、1450 μg/L, CA的质量浓度为8.65 μg/L、17.3 μg/L、43.25 μg/L、86.5 μg/L、173 μg/L、 346 μg/L、865 μg/L、1730 μg/L，Pin的质量浓度为8.23 μg/L、16.46 μg/L、82.3 μg/L、164.6 μg/L、329.2 μg/L、823 μg/L、1646 μg/L；按照优化后的色谱条件对每个点重复测定3次。以质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，以标准曲线的第一个和最后一个点的质量浓度作为线性范围。

不同浓度梯度的Lar、CA和Pin通过C18柱时在线性范围内呈现良好的线性关系；系数均在0. 99 以上，均符合实际分析的要求^[⁴^]。

图1 Lar标准曲线

图2 CA标准曲线

图3 Pin标准曲线

表2 Lar、CA和Pin标准曲线、线性范围、决定系数、检出限和定量限

化合物标准曲线方程线性范围(μg/L) 相关系数检出限(μg/L) 定量限(μg/L)

Lar y＝422.9818x 7.25-1450 0.9996 1.25 3.75

CA y＝33.6037x 8.65- 1730 0.9996 5.10 15.60

Pin y＝9433.8945x 8.23- 1646 0.9998 3.59 10.77

3.2实际样品的测定

用建立的方法测定40份小麦类样品，部分样品的色谱图如图4所示。

图4 小麦叶片中Lar、CA和Pin的色谱图

且同一批次样品3次平行样得到T6P和Tre的RSD 值小于3%，如表3所示，说明前处理方法可行，仪器的稳定性良好^[^5]。

表3 小麦叶片中Lar、CA和Pin的测定值

分别对小麦不同组织的样本进行前处理提取实验，前处理方法简便可行，仪器性能可靠，满足对样品中松柏醇、松脂醇、落叶松脂素的检测。

参考文献

[1] 周海旭. 樟树叶中木脂素提取分离及其生物活性研究[D]. 2017.

[2] 戴清源,朱秀灵,刘皓. 芝麻木脂素及其生物活性研究进展[J]. 农产品加工.学刊, 2012, (1期):16-21.

[3] Du, Bingyuan, et al. Phillygenin exhibits anti-inflammatory activity through modulating multiple cellular behaviors of mouse lymphocytes[J]. Immunopharmacology and immunotoxicology, 2019, 41(1): 76-85.

[4] Murata, Jun, et al. Oxidative rearrangement of (+)-sesamin by CYP92B14 co-generates twin dietary lignans in sesame[J]. Nature communications, 2017, 8(1): 1-10.

[5] Hano, C, et al. Pinoresinol-lariciresinol reductase gene expression and secoisolariciresinol diglucoside accumulation in developing flax (Linum usitatissimum) seeds[J]. Planta, 2016, 224(6): 1291-1301.

附件：

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