主题：【分享】【金秋计划】天然产物雷公藤红素抑制耐药金黄色葡萄球菌的直接靶点

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发表于：2024/09/10 15:12:51 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是医院感染最常见的病原体，已成为全球主要的公共卫生威胁之一。随着“超级细菌”耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的出现和迅速传播，治疗金黄色葡萄球菌感染变得愈发困难，临床上迫切需要发现新的超级抗生素来应对超级细菌的威胁。

天然产物雷公藤红素在体外和体内均能有效对抗MRSA，且雷公藤红素靶向Δ1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（Δ1-Pyrroline-5-Carboxylate Dehydrogenase，P5CDH）发挥抗MRSA作用。机制上，雷公藤红素通过与 P5CDH 结合诱导氧化应激并抑制 DNA 合成。这项研究的结果表明雷公藤红素是一种有前途的先导化合物，并证实 P5CDH 是开发抗 MRSA 新型药物的潜在靶点。

1、雷公藤红素在体外表现出对抗 MRSA 的强效活性

作者首先通过体外实验发现雷公藤红素对MRSA USA300表现出显著的抗菌活性，最低杀菌浓度（MBC）为8μg mL ?1，在浓度为1和2 μg mL?1时，雷公藤红素完全抑制了菌株的生长，根据MBC和MIC值确认雷公藤红素是一种很有前途的抗 MRSA药物。

2、雷公藤红素在不同感染模型中表现出潜在的治疗能力

作者通过体内实验评估雷公藤红素在3种不同感染模型（大蜡螟幼虫模型和两种小鼠感染模型）中的治疗能力，发现雷公藤红素提高了被MRSA USA300感染的大蜡螟幼虫的存活率，改善小鼠的MRSA皮肤感染，提高MRSA菌血症模型的存活率。这些结果表明雷公藤红素具有优异的体内抗MRSA活性。

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3、多组学分析发现新型抗 MRSA 靶点

接着研究人员通过转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析了MRSA治疗后的细胞变化，揭示了雷公藤红素抗MRSA活性的可能靶点，多组学分析表明雷公藤红素上调应激反应和氧化磷酸化，而下调氨基酸和核苷酸、天冬氨酸、谷氨酸和嘧啶代谢的生物合成。这些代谢通路与Δ1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶（P5CDH, 由rocA基因编码）相关。因此，作者推测P5CDH是抗菌药物开发的潜在靶点

4、P5CDH 是一个潜在的抗菌靶点

为了进一步确定P5CDH作为潜在的抗菌靶点，作者构建了MRSA USA300 rocA敲除菌株和补充菌株（Δ:: rocA ），发现rocA缺失显著损害细菌生长，而补充菌株在生长方面与WT相同。此外，突变后雷公藤红素对MRSA的MIC由1变为8μg mL?1，而补充rocA基因后又恢复到1μg mL?1，说明雷公藤红素的抗菌活性部分是通过抑制P5CDH来实现的

5、雷公藤红素与P5CDH直接结合

由于蛋白质组学分析中雷公藤红素并没有显著影响P5CDH的表达，因此研究推测雷公藤红素通过靶向P5CDH并影响其功能来发挥抗菌活性。接着通过分子对接、BLI、CETSA、圆二色谱和酶活性测定，证实雷公藤红素能够直接结合影响P5CDH，影响其酶活

6、K205A和E208A是P5CDH与雷公藤红素的关键结合位点

接着，作者采用了分子对接和定点诱变技术揭示雷公藤红素结合位点。分子对接成功预测出3个结合位点，分别为Lys205（K205A）、Glu208（E208A）和Asp209（D209A）。随后，作者构建了三个突变质粒并表达相关蛋白。BLI分析显示K205和E208突变后雷公藤红素结合能力显著降低，且不再抑制其酶活，表明K205和E208是结合的关键残基

7、雷公藤红素促进氧化损伤

有文献报道P5CDH通过影响P5C-Pro循环的平衡进而对产生ROS至关重要，作者推测雷公藤红素可能通过氧化损伤发挥抗菌作用。通过对WT 或 Δ:: rocA 组、Δ rocA组菌株采用雷公藤红素或乙醛酸（P5CDH抑制剂），发现雷公藤红素扰乱P5C-Pro循环的平衡。此外，ΔrocA、雷公藤红素或抑制剂处理组的ROS水平升高。其中，雷公藤红素治疗组ROS升高最为显著，可能是因为雷公藤红素是一种多途径抗菌剂，可以通过多种方式刺激ROS生成。结果表明氧化损伤是雷公藤红素重要的抗菌机制

8、雷公藤红素诱导细菌死亡

为研究雷公藤红素处理后MRSA死亡情况，作者用DAPI标记细胞中的DNA，在ΔrocA、雷公藤红素或抑制剂处理组均观察到染色体凝聚，提示有细菌死亡发生，特别是雷公藤红素处理的细菌出现了凋亡小体形成和萎缩等细菌死亡形态学特征。在TUNEL染色实验中，与未接受药物处理的WT细胞相比，雷公藤红素处理的WT细菌荧光较强，提示有DNA双链断裂出现

9、雷公藤红素抑制DNA合成

前面多组学结果发现雷公藤红素影响谷氨酸和嘧啶代谢的生物合成，该过程与DNA合成密切相关，作者推测雷公藤红素可能通过抑制DNA合成发挥抗MRSA活性。结果显示，用雷公藤红素或抑制剂和ΔrocA组处理的细菌中NADP+/NADPH比率降低，表明5-磷酸核糖的合成受到抑制。Asp是嘌呤和嘧啶合成的重要前体，作者发现Glu和Asp的减少。此外，作者观察到DNA含量下降。考虑到DNA能够影响蛋白质的表达，作者也观察到ΔrocA、雷公藤红素或抑制剂处理组的蛋白质含量均显著降低，表明P5CDH能够影响蛋白质的合成。总之，雷公藤红素可以抑制DNA合成来对抗MRSA

总结

该研究表明，雷公藤红素对标准和临床耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株表现出强大的抗菌活性，并且耐药性发展水平较低。这种抗菌活性的机制被认为是基于与P5CDH的竞争性结合，从而激活多种途径。雷公藤红素是开发用于对抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌相关感染的新型抗生素药物的有希望的候选药物

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