主题：【转帖】GC分析的ABC---烘箱中發生的事情

GC分析的ABC---split与splitless
现在就让我们来看看split和splitless到底是怎么回事!! 
split
大家应该都知道split mode的注射方式应用于浓度较高的分析样品,注射时分流阀会打开,当样品打入liner气化后,大部分都分流出仪器以外,只有小部分进入管柱中,为了尽量维持进入管柱中的那部分样品组成能与原来样品的组成相符,所以这种注射方式的关键就在于样品气化的速度与程度. 
要使汽化快速而且完全,首先就得有够高的injector温度和适当的liner,split用的liner特点就是管内供给汽化所用的表面积超多,螺旋状的,杯状的....一大堆各式奇怪的形状都有,但我始终觉得还是填塞玻璃棉效果最好,容易更换,还可以随意调整高低. 当然,你还得注意liner的容量,当样品在liner中汽化后,他的体积会突然间快速膨胀几百倍, 容量不足的liner会使汽化及未汽化的样品由septum purge的出口被推挤出去,因而产生流失. 这种突然产生的压力波, 可以由慢速的注射方式(也就是说使plunger慢慢的将样品推入liner中)可以降低这种影响, 但却会形成注射口的discrimination,亦即造成高沸点的被分析物无法和低沸点的分析物一同进入管柱中, 常见的状况就是图谱中时间越往后面的,尖峰面积也越来越小. 最恰当的注射方式就是使用快速注射法, 同时搭配hot needle(前面有post提过)或者是solvent flush法, solvent flush法就是注射针先吸一段溶剂, 再往上拉一段空气,然后才是将样品吸入注射针中, 利用溶剂再快速的
注射法中, 将整个样品推出针外! 
注射针插入liner中的深浅位置也会影响, 针尖越接近管柱入口, 越能使更多的样品进入管柱中！！

Splitless
用于分析低浓度样品的splitless模式注射法, 为了使样品能完全进入管柱中, 所以当然会关闭分流阀! 所以这也就使得受到上面所说的压力波影响, 要比split法大得多, 所以要有好的注射结果,使用慢速注射法似乎解决的方法之一, 当样品被缓慢的推入liner中(当然可以加上hot needle法, 但是千万不能用solvent flush法！), 在splitless的模式下, 无论高或低沸点的分析物,都会有足够的时间汽化进入管柱中, 直至purge的时间一到,阀门打开后, 那些为气化的
东西才会被扫出仪器外,看似单纯, 其实不然, 比前述的split要复杂多了.!!
你使用的溶剂沸点最好能比在你分析物中沸点最低的那个物质还要低个20度左右, 不然有可能使那些分析物产生拖尾的状况! 这个现象我还真的碰过, 换了种溶剂, 拖尾的现象还真的是改善了(产生的原因大家可以猜猜看,考考大家的功力!!). 
当然, splitless注射方式可以让样品有较长的时间停留在注射口中,因此可以使用较低的注射口温度, 但是随着镕剂大量进入管柱中, 当开始升温时, 溶剂所造成的solvent peak却也会影响分析结果, 所以你要找一个适当的purge时间, 时间一到就把未汽化的东西扫出仪器以外, purge时间太长, solvent peak就有可能大到拖尾,影响到低沸点分析物的积分值, 或者是整个覆盖了分析物. 一个好的purge时间, 所获得的solvent peak是长方形的(当然, 你要是用GC/MS的话, 由于solvent delay时间的设定, 你不会看到这个长方形, ECD等有选择性的侦测器也是看不到的), 如果是获得拖尾的形状就表示你的purge time设得太长了!
当然, 事情还没结束, 如果你够心细, 你会发现一个问题: 长时间的气化, 长时间的进入管柱, 要用甚么方法才能让分析物在管柱中不会产生band broad 或者是在图谱上产生拖尾的状况(split的快速汽化及分流,没这方面的问题)?, 这就需要一个温度够低的烘箱.所以有时烘箱起始温度需要降到三十度以下(甚至于还有更低的), 不是没道理的!!

最近的几篇有关管柱的讨论,其中的某些观点似乎是值得拿出来再加以澄清的,当然这是我的看法,如果有不同的论点也是可以再提出来......毛细管柱一般都不会便宜, 在进行某些步骤时需要多多考虑一下!! 
1. 新的管柱需要再加以condition( 老化)吗??
当然需要! 但绝对不需要花整夜的时间来condition! 尤其是不论青红皂白的在持续高温下整夜的加热condition,这对管柱其实是很大的伤害,就算是一支严重污染的管柱都不一定需要如此做,更何况还是一支新的. 事实上,在管柱的包装盒中都会有告诉你这一支新管柱的Condition方法,照着做,如果无法达到你的要求, 再换更激烈一点的方法还不迟! 
2. 使用过的管柱要怎么做Condition?
最大的忌讳就是前一项中所提的,绝对不要长时间在高温下烘烤你的管柱,即使你的温度已经调到管柱的最高耐温下30度,也不要如此做!! Condition应采低温==>高温==>降温==>升温==>高温==>降温.....的模式操作,就是在一个操作的program中设定好多次的升降温度. 那么高温要到几度? 两种做法:一是依照你管柱所能承受的最高温度再降30度. 另一种就是你分析时所用之program的最高温度. 我通常都是使用第一种的设定方式. 
3. 到底要Condition到甚么程度下才可以正式run样品?
这要看你仪器感度和分析的需要,而不是一成不变的用同一个标准! 如果你是分析高浓度,几个ppm以上的样品,其实你的管柱不需要太多的Condition! 如果你的分析物出来的时间较后面,且浓度较低的话,就必须使用比较严苛一点的方式和久一点的时间了! 例如在我的实验中,如果是需要低浓度接近MDL的分析考试, 在前一天的下班时,就会设定一连串空针的空针(使用明天要用分析program ), 一直run到正式的样品上机为止.
4. 管柱可以用有机溶剂清洗吗?
一般WCOT和cross link的管柱都没问题! 在DB和HP的管柱使用说明中就有说明哪些DB和HP系列的管柱不可以使用有机溶剂清洗. 
5. 甚么东西是绝对不可以注射进入管柱的?
无机酸和碱是最大的忌讳,几乎所有类型的管柱都无法忍受!!
6. 水呢? 可以用水清洗管柱吗? 可以直接注射水样进入管柱吗?
其实最近的一些讨论内容中,水是否可以进入管柱中,是个讨论的重点, 一般GC分析员的的观念中,视水为GC管柱及GC仪器本身的大敌, 但事实上水没那么可怕! 除了几种静相之外,水不但可以可以直接注射进入管柱中,甚至于可以如有机溶剂一般来清洗管柱.

在手上的一篇J&W公司(DB管柱的制造厂商)的数据中显示(很久以前从网络下载的,已经忘掉地址了),在三种静相性质完全不同的管柱B-wax, DB-1和DB-225,分两种状况来实验,一是以水样注射,第二种是先以3mL的水清洗,在依序接着以1mL的甲醇,二氯甲烷,正己烷等冲洗后,以相同的物质在前述两种实验方式的前后分别注射(不同的管柱分析物并不相同),可以获得下列的数据 "before Inj.表示为实验前, "After Inj.表示为注射水样后,"After rinse表示为以水清洗后)

DB-1
Parameter Before Inj. After Inj. After Rinse
Ret. Factor 14.6 14.5 14.5
Ret. Index 1 1349.88 1350.02 1350.05
Ret. Index 2 1427.77 1428.16 1428.07
Theor. plates 1448 1474 1391
Bleed(pA) 12.8 11.2 21.5
DB-wax
Parameter Before Inj. After Inj. After Rinse
Ret. Factor 12.6 12.6 11.7
Ret. Index 1 1149.54 1149.73 1150.82
Ret. Index 2 1163.44 1163.71 1164.13
Theor. plates 1277 1261 1268
Bleed(pA) 50.5 97.8 97.6
Bleed2 42.2 41.0 39.6

DB-225
Parameter Before Inj. After Inj. After Rinse
Ret. Factor 11.5 11.4 11.2
Ret. Index 1 1622.30 1621.26 1620.97
Ret. Index 2 1711.51 1711.03 1710.77
Theor. plates 1101 1110 1160
Bleed(pA) 15.0 114.0 53.9
大概的结论是:
a. 管柱注射水样后对于:polarity, selectivity, retention time, efficiency, activity等并无太大的改变.
b.对于管柱的Bleeding方面:100%的DMPS无影响,但PEG和50%的cyanopropyl phase仍需继续观察下去.
c.Non polar管柱对于注射水样和以水清洗管柱并无影响, 对于polar 的管柱(bonded,和cross-link)而言, 水样的注射亦无影响. 但不推荐使用水去清洗管柱.
在我还是研究生的阶段,就已经使用FID,直接注射水样来分析五氯酚的实验....
至于有人说注射水样会使得FID的火熄灭,其实应该要先检讨一下空气和氢气的流速和流速比是否正确.....但是ECD则持保留的态度, 那东西是超级怕水的!!

7. 分析的后段在高温时, base line会隆起,需要condition管柱吗?
毛细管柱在烘箱中,除了在是温以外,只要温度一升高,就一定会产生bleeding, 在高温时当然最多,尤其是当你使用膜厚较大的管柱时,这种情况特别严重! 需不需要就看你要求的侦测极限,当管柱的bleeding大到遮住你的分析物时, 这时你再怎么去加热Condition也没有用! 还不如视情况换一支较小膜厚的管柱......

liner的去活化方法
有网友询问, 所以还是贴出来让大家看看,有需要的就拿去用........
liner在去活化之前应先用溶剂或肥皂水将其刷洗干净, 另外可以用木质柄的棉花棒, 于溶剂或肥皂水中刷洗liner的玻璃管内部, 如无木质柄的棉花棒,则一般的塑料柄的棉花棒则只可于肥皂水中刷洗, 最后冲洗干净,干燥后进行去活化的步骤.
干燥后的liner先以玻璃吸管吸取甲醇冲洗, 反复数次, 然后溶剂换成EA,以玻璃吸管吸取冲洗liner, 最后把溶剂换成n-hexane重复前面所述的步骤, 要注意的是溶剂使用顺序不可以变动!!
将二氯二甲基硅烷和甲苯以1:9的体积混合,并以表玻璃加盖 ,需注意盛装这个混合液的玻璃容器,本身也会与前述的混合液反应, 故在使用后会有一段时间其容器内部会呈现疏水性质, 将前面以n-hexane洗干净的liner放入其中,要注意在liner的管壁上绝对不可以出现气泡, 当所有的liner都放好后,盖上表玻璃, 于抽气厨中静置1~2小时 !!
将反应完成之liner取出(每次一支, 其余的浸泡在反应剂中,绝对不要一次将所有的liner拿出来暴露于空气中), 先以玻璃吸管吸取n-hexane冲洗, 然后以EA冲洗, 最后是以甲醇冲洗,顺序不可以颠倒!! n-hexane是要洗掉未反应的二氯二甲基硅烷, 而最后的甲醇是要和在已经和玻璃表面反应的二氯二甲基硅烷, 另外的一个-Cl基团反应(end cap), 所以如果顺序搞错的话是很凄惨的事情.........
上面的步骤结束后,可以将liner置于高温烘箱中,在300度下烘一个晚上!! 隔天早上取出时, 须于干燥皿或烘箱中降温, 而不要于空气中, 这样你的liner会很快速的开始吸收水气....
最后将liner置放于防潮箱中保存!!
反应的副产物是气态HCl, 要全程在抽气厨中操作!!!
二氯二甲基硅烷会与空气中的水分反应, 注意存放的条件!!

内标准品的选择 
传统上在教科书中都会很模糊的告诉学生内标准的选择方式,例如说要选安定性好;与分析物性质要相近;在分析的基质中不能出现等,现在我对这些个" 选择方式"没有太大的兴趣,因为这个大家都知道,那现在就从另一个角度的来看看内标准品的选择还有哪些需要注意的.

1. 只选一个内标准品?
当然, 如果你的分析目标物就只有一个, 在正常的状况下,内标准"应该"也只会有一个才对! 但是如果你的分析是多成份的,那就必须十分小心地看待在一个分析方法内标准品的选择, 如果分析物的在层析图中是平均分布在各处, 那你就必须看看你的检测方法中是否有规定内标物与分析物之间的滞留时间差范围是多少,依此规定来选择内标,但是如果并没有规定,最好也是选择一个以上的内标来使用,因为即使化学性质不会差太多,但在沸点方面却会有满大的差异, 内标与分析物的沸点差异过大,在GC的注射口中就无法把因为discrimibation所造成的误差校正回来.

如果你的分析物是性质相差颇大的 (例如说同时含有醇,酸...),那别怀疑一定是要使用一个以上的内标准品,如果多个物种再加上多成份,那就很复杂了. 最低的限度也要依照分析物的沸点高低来使用多个不同的内标准品. 在美国环保署的检验方法USEPA 8270C,是一个检测半挥发性的污染物的规范,前后列了不下一百种的分析物,就使用了六个不同的内标准品作为校正的依据,来照顾到各个不同沸点的分析物!!
滥用药物分析大概是最严谨的了,即使是结构性质极相近的分析物,例如morphine和codeine,amphetamine和methamphetamine,在分析时为求准确,都是以各自的D同位素取代的标准品作为内标.

2.基质中一定不能存在?
这个问题当然是肯定的, 不然定量结果会很不稳定或者是很凄惨. 但是有些时候你根本不知道哪些东西在分析样品的基质中不会存在! 这时候怎么办? 找以往的文献看看别人是用甚么,这是一个方法, 但要注意的是文献不一定就是对的! 使用分析物的氢同位素(D)取代物,是最妥当的,但问题是价格昂贵,而且不是每一种分析物的氢同位素(D)取代物都有贩卖,当然,如果本钱够,你可以去订购专门替你合成氢同位素(D)取代物. 如果要自己选, 那就必须了解一下分析物的成分了.
以前曾经替人定性和定量过一阵子海水鱼中所含不饱和脂肪酸,这鱼中不饱和脂肪酸的碳数都是奇数(或是偶数, 我已经忘了), 所以内标就使用了几个偶数(或奇数)的不饱和脂肪酸, 像这种内标物绝不可能出现在分析物中,且性质十分相近,所以定量的结果一般误差都不会太大! 如果完全无法确定怎办? 有时候就是赌一赌啰.........举例来说:如果你的分析物结构中含有氯的话,就可以寻找一个化合物,而这个化合物是把其中的氯换成氟或溴,例如你可以使用2-氟联苯或2-溴联苯来当作分析2-氯联苯的内标准品. 以环境分析为例,通常在自然界中的氟及溴化物并不多, 在EPA的方法中,就经常把结构相似的氟及溴化物添加入样品中,来做为分析含氯化合物的QC样品.所以找氟及溴来取代氯原子的化合物来作为内标,基本上还算是很安全的.
如果实在连上述转换一个基团的内标都找不到,那至少在选择时一定要找同一类的,分析酸就找酸当内标,分析醇就找醇当内标,直链接构分析物就不要找一个环状的化合物来当内标,分子量不要相差太大,这算是最基本的要求!!
3.内标和分析物的滞留时间必须接近?
这个说法原则上没错,因为如果滞留时间接近,它们的物理或者是化学的性质在某种程度上是接近的,所以有些分析方法会有这样的规定. 但在某些特殊的状况下却出了问题, 事实上还真的碰过, 结果在更换到第三个内标准品后, 它的RT远离分析物, 反而解决了定量误差的问题!! 这个案例以后有空在来聊聊. 

4.内标的浓度应该是多少?
除了某些分析方法会规定必须加入多少浓度的内标外,其它的就只能靠分析员自己来决定了. 以我为例, 通常会先决定一个分析方法的检量线范围,然后开始配制不同浓度的内标准品来注射入仪器中,分析完后选出一个大概是检量线最高浓度的波峰高度三分之二左右的浓度,作为该项分析的内标浓度. 这样的选择方式,可以兼顾到高低浓度的需要,一般来说,内标浓度过高除了会增加成本之外,对于低浓度的校正是会产某些程度的误差.
在某些分析方法中会强制妳使用内标法而不是外标法或线性回归的方式来定量,但是如果你的基质很复杂,一针打进仪器中,结果大大小小的出来一堆波峰, 这个时候如果你又不是使用质谱作为侦测器的话,就必须考虑加大内标准品的使用浓度, 来降低内标准品的可能发生的积分误差!!

5.内标准怎么配制?
一但决定了添加内标准品的浓度,就可以开始配制分析时所用的内标准品标准溶液,相对于测试时的小量, 分析员必须先估计妳在这一批的分析样品有多少, 然后计算整个分析需要添加入多少的量,例如说妳需要大概100mL的内标准品标准溶液,这时就必须再加多30%以上,一次就配好整个分析要用的量! 分装或者是整瓶放到-20度的冰箱中存放,免得做到一半发觉内标准品标准溶液用完了,再重新配制一次,如果你是分析的新手, 搞不好前后两次配得不一样浓度,那就会很凄惨了…..有些领域的分析,很重视这种内标波峰的积分值是否是有一定的再现性!!

这一部分的内容对于色层分析的新进人员, 无论是GC或HPLC, 多多少少都会有一点帮助, 尤其是觉得检量线老是
有问题的分析人员, 可以参考一下.....
1.检量线的种类有哪些?
通常校正之检量线大概可以分为两大类: 线性(linear)与非线性(nonlinear). 线性校正检量线为直线通过原点(0,0)的零次校正,和不通过原点的一次校正. 而非线性校正则为二次校正或更高次的校正. 今天的重点则是放在最常使用的线性校正上.线性校正在实际的使用时,最常见的就是"线性回归校正法"(linear regression), 感应因子法(内标法)及校正因子(外标法)等三种.
2.检量线的最高及最低浓度差的限制是多少? 最低浓度要怎么设定?
这个其实并没有明确的规定, 视各分析的领域而定,当然唯一的要求就是一定要在线性范围之内, 通常会要求liner regression法的 r 值在0.995以上, 而内(外)标法感应(校正)因子相对标准偏差必须小或等于20%.在实际的使用上, 高低浓度差越大,将会得到更大的误差, 这种误差在整个检量线中,以低浓度的范围最大, 高浓度的范围次之, 以检量线的中段最小, 这其实是很容易了解的, 因为所谓线性回归,就是把一条曲线硬是拉成一条直线来使用, 这种由弯曲而拉成直线的误差 , 以在检量线的头尾两端最大,在以百分率表示时,低浓度的误差就变成一条检量线中最大的了.
在仪器分析中, 高低浓度差还要考虑到侦测器的线性范围, 通常就我本身所用的分析检量线,一般最高与最低浓度差,大概都在10倍左右, 最低浓度"尽量"设定在MDL的3.3倍左右, 如果你用的是LOD, 也就设定在LOD的3.3倍,虽然LOD和MDL并不一样........, 另外, 如果知道分析样品的大概浓度, 也最好尽量调整样品的浓度, 让待测物的浓度位于检量线最高浓度的20%～80%之间!!

3.甚么样的检量线才可以用!?
当然,前提是必须先符合前面所说的: liner regression法的 r 值在0.995以上, 而内(外)标法感应(校正)因子相对标准偏差必须小或等于20%. 如果你的分析方法够严谨,就有下面更进一步的管制标准: 你必须注射一针标准品, 通常是检量线的中间浓度, 分析后的数据代回校正方程式, 如果误差在20%或15%(对于linear regression是浓度偏差, 内标法是感应因子相对标准偏差, 外标法则是校正因子相对标准偏差 )以内才算是及格可以使用,否则就必须重新制作检量线. 更严谨的作法是以第二个标准品来源(通常就是与制作检量线之标准品不同制造商), 配制检量线中间点的浓度,如前一般注射分析计算, 通过前述的管制标准才可以!
以往所见过管制最严格的 方法, 在药物分析 BA/BE测试, 甚至于规定检量线中每一点所得的积分值皆须代回线性方程式中计算浓度, 如与本身误差超过15%就算不合格....
就linear regression而言, 如果你相信 r大于或等0.995, 这一条检量线就可以拿来定量, 有时会有悲惨的后果, 因为这样会产生很大的误差! 例如很多的因素会造成回归直线在坐标上的截距改变, 像这种类似"平移"的变化, 对 r值并不会有太大的变化, 但是"平移" 前后所计算得到的浓度却会有很大的差别.
4. 检量线中需要多少点(浓度)?
一般至少五点! 其实点数是越多越好, 但是要考虑成本及分析时间的问题, 有些分析法会制作六点,容许你删去其中的一点, 但是在这种状况下, 最高和最低浓度是不能被删除的!!
5.检量线中"截距"的意义是甚么?
检量线的每一个浓度经过仪器的分析后,都会产生一个相对应的讯号,假如我们忽视侦测极限的存在,从高到低一直到浓度为零的时候, 这条线应该是要经过坐标的原点(0,0),在实际的状况下却绝少发生, 为甚么会这样? 因为还有仪器的噪音! 在重复制作检量线时, 可以观察到截距是会有变化的,在这个时候,除了仪器的噪音外,还要加上人为的操作误差及不稳定度. 所以一位从事定量分析的新进人员, 初步的考验就是令其重复制作检量线, 由截距及斜率的变化, 可以很容易判断出来该分析员一些基本操作, 例如标准品的稀释是否熟练...........
现在既然我们知道了截距所代表的意义,那么截距与定量浓度之间又有甚么样的关系?? "假设"我们的人为操作的误差为零,或经由多次的分析制作检量线,所得到的平均"截距"事实上应该就可以代表仪器本身在分析时候所产生的噪音, 这种噪音的量化方式,可以取代人为主观意识的测量, 例如制作噪讯比值(S/N ratio).在决定了噪音值的大小后,以S/N=3为例,最快的方法是直接在捡量线的Y轴上量取3a(a代表截距)的高度,此点讯号值的对应,即为分析物产生S/N=3所需之浓度. 另外,分析员可以藉由不同浓度的标准品注射,由分析物所产生的讯号(波峰面积或高度)与截距的比值,也可以直接得到产生S/N=3所需之浓度. 许多教科书上的说法都是由眼睛观察出来, 并无数据上的支持,甲看是1:3, 由乙来看说不定变成1:4 ! 尤其是气相层析,低温及高温区域所得到的噪音是完全不一样的.......
另外,如果你的眼睛够尖锐,会发现某些检量线的低浓度部分会位于Y轴3a下方, 这些部分的直线虽能符合品管规定(如r=0.995),但定量结果一般都还是不予采用的!! 所以前面强调过,调整分析物浓度尽量不要让 它们的讯号值落在捡量线的低浓度部分....
有空闲的话,可以试试看另外一种"变形"的检量线: 配制至少五个浓度高于IDL的一系列标准品, 每个浓度注射分析七次,求每一浓度产生讯号的标准偏差, 所得的七个值点在以浓度为X轴,讯号值为Y轴的坐标上,并线性回归得一直线,此直线的截距假设为a,3a就是你这个分析之LOD, 10a就是LOQ!! 这也是众多LOQ, LOD的制作方法中的一种.

这是来自台湾的cation老师的原创文章，LZ在转帖时为什么不标明作者和出处？甚至连“转帖”二字都不肯写！！！