三. 实时定量的数据分析
1. 数据分析切换到Result页面,进入扩增曲线(Amplification Plot)子页面,查看软件已经自动分析好的实验结果。注意:此时的数据是软件根据默认值(基线起点为3,终点为15)得到的初步结果,还需要根据本次实验的具体情况,精细调节Baseline(基线)的起止点后,重新分析,以得到更精确的数据。
2. 基线的起点和终点确定原则基线(Baseline)是指
PCR开始时信号很低、接近背景且比较平稳的那个阶段。起点要避开开始几个循环由于高温导致的信号增高,设在信号已经降到背景高度且能维持平稳的地方,一般在3到6个循环之间;终点要避免覆盖信号已经开始有明显增长的地方,一般在本组数据中最小的CT值前再3个循环处。另外,起点与终点之间最好能间隔8个循环以上,以满足统计基线标准偏差的数学要求。调整好起止点以后,再点击Analyze按钮,软件即自动计算新的阈值和CT值,并更新实验报告。注意:此时扩增曲线页面上显示的阈值数字并不更新,但是这不影响后台数据运算的准确。
3. 线性图谱在默认的设置中,
PCR扩增曲线图谱的纵坐标代表经过ROX和空白校正后的相对荧光信号强度,横坐标代表
PCR循环次数(从1到40);纵坐标以对数表示,横坐标以线性表示。如果要看完全线性的S形图谱,请双击纵坐标轴线,打开坐标设置窗口,将纵坐标改成线性形式。
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ABI Prism 7000中文操作手册4. 原始数据切换到Component子页面,察看原始数据。正常的FAM信号强度,基线时约为5000点,扩增完成达到约28000点,中间呈S形增长;TAMRA和ROX的信号开始时都比FAM的基线要稍低一点,TAMRA信号到指数增长阶段会降低,而ROX信号是水平稳定的,不随
PCR进程而改变,因为ROX是以固定浓度加入到
PCR试剂中的,它本身并不参与
PCR扩增。
5. 原始数据切换到Spectra子页面,也可以察看原始数据。Spectra与Component这两个页面的区别是:Component显示的是信号强度随时间(即
PCR循环次数)的变化,是纵向的;而Spectra显示的是每个
PCR循环点上信号强度在不同波长上的分布,也就是在4个滤色片上的分布,是横向的。
6. 标准曲线切换到Standard Curve子页面,察看标准曲线。注意:只有在Set up时输入标准品的拷贝数后,软件才能自动生成标准曲线。
7. 实验报告切换到Report子页面,察看实验报告。确认无误后,保存结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型,输出各种类型的数据,包括CT值、相对信号强度、原始数据、融解曲线数据和实验结果等。输出的数据可以用Excel打开,并可在Excel中重新生成扩增曲线、标准曲线等图谱。
四. 终点读板的软件运行
各种等位基因鉴定实验,包括SNP检测、基因突变检测等,都包括两个阶段:1、
PCR扩增;2、扩增后的荧光信号读取(Post-read)和数据处理。第一步既可以在9700、9600等普通的
PCR仪上进行,也可以在7000、7900等定量
PCR仪上进行;第二步
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ABI Prism 7000中文操作手册必须在定量
PCR仪上进行。以下只叙述第二步Post-Read和数据处理的操作方法。如果第一步也在定量
PCR仪上进行,请按第三节实时定量的实验方法设置和运行软件;待
PCR完成、数据保存好后,再将同一块板放在7000上,按以下步骤操作。
1. 新建文件菜单File → New,Assay选择Allelic Discrimination (终点读板模式,用于SNP分析等),新建一个空白96孔板文件。
2. 探针设置双击任意一个孔,打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。
3. 首次使用软件,或者Marker没有设置好,先点击Add Detector按钮,打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针,File → New,新建探针,设定探针的名称(建议使用等位基因的名称加标记荧光,如Allele 1_FAM、Allele 2_VIC等)、报告基团(FAM或者VIC)、淬灭基团(TaqMan探针选TAMRA;MGB探针选None)、颜色(任意指定)等。设置完成后点击OK,该探针即出现在探针列表中。
4. 位点设置Detector设置好后,点击Add Marker按钮,打开Marker Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Marker Manager打开。如果在Marker列表中找不到合适的探针,点Create Marker,取名(建议使用位点的名称,如D2S1356等),OK,新位点的名字即出现在左边的位点列表中,选中位点,在右边的探针列表中打钩选择与该位点配套的探针,一般FAM、VIC各一个组成一套。
5. 选择位点Marker设置完成后,在左边的位点列表中选中该Marker,点击Copy to Plate Document按钮,该Marker的信息即分成3行出现在Well Inspector窗口中。重复选好全部所需Marker,再点击Done关闭Marker Manager窗口。注意:定量
PCR实验只要求设置探针(Detector)即可,而SNP实验既要设置探针(Detector),还要设置位点(Marker)。如果没有设置Marker,软件将不能进行基因分型。
6. 填样品表在96孔表中选定有同类样品的一个或多个孔,在Well Inspector页面的Marker列表的Use项下的方框中打钩,选择要用的Marker,然后在探针的Task栏选择指定样品类型:阴性对照选NTC;未知样品选Unknown。没有Std。
7. 参比荧光如果用的是ABI公司的
PCR试剂,如TaqMan Universal
PCR Master Mix with or without UNG,参比荧光(Passive Reference)选ROX;如果所用试剂中不含ROX参比荧光,请选None。
点击右上角的X按钮关闭Well Inspector窗口。
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ABI Prism 7000中文操作手册8. 循环参数切换到Instrument页面。
PCR热循环程序只有60°C一个步骤,不需要修改。设置反应体积。SNP的标准反应体积是50 µL。点Save按钮保存文件设置。
9. 终点读板确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后,点击Post-read按钮,开始读取数据,大约10秒完成。
10. 保存结果程序结束后点Disconnect按钮,然后File → Save保存实验结果。
五. 终点读板的数据分析
1. 数据分析切换到Results页面,Allelic discrimination子页面,在Marker下拉菜单中选择要查看其数据的Marker,在下面96孔板界面中按Excel方式选择需要查看的样品孔,软件即在中间的图谱上显示信号的分布情况。选择不同的Marker,显示不同的信号。可以点击放大或缩小工具调整图谱的大小。
2. 信号分布正常的信号应该分为4组,靠近原点处为NTC;靠近X轴的是VIC信号,是纯合子,其正常信号强度范围在2-8之间;靠近Y轴的是FAM信号,是另一种纯合子,其正常信号强度范围在4-16之间;靠近对角线位置的样品中既有FAM信号也有VIC信号,是杂合子,强度为FAM和VIC各自的一半左右。
3. 基因分型点击套索工具,然后通过鼠标圈定NTC信号,在Call下拉菜单中选NTC,这些数据点即被分型为NTC并显示相应的颜色和图标;同样分型FAM纯合子、VIC纯合子和杂合子。
4. 保存结果切换到Report页面看实验报告。确认无误后,保存分析结果。也可以从File菜单中选择Export,再选择数据类型,输出各种类型的数据。
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ABI Prism 7000中文操作手册六. 日常维护
1. 荧光污染的检查与处理新建一个空的96孔板,菜单Instrument → Calibrate打开ROI Inspector窗口,将Exposure Time调到4096,选定Filter B,点击Snapshot按钮(不要动下面两个按钮,以免ROI设置出错),此时可以看到排列整齐的96孔图像。如果观察到特别明亮的光斑,则表明该孔存在荧光污染。将光标移动到单个孔的上方可在右侧栏中的Pixel Intensity处读出该孔的荧光信号值,超过500以上的需要清洗。清洗时尽量使用较细且无硬物突出的干棉签擦拭;如果未能去除,可用去离子水清洗;如污垢顽固,可使用90%乙醇清洗,但要等乙醇完全挥发干净后方可盖上热盖,以免有机溶剂损伤热盖上的透镜组。
2. 检测器光源的更换流程关机冷却约15分钟后,打开仪器顶部盖板,拧松灯泡保护罩的螺钉,取下保护罩,将灯泡拆下,更换新的灯泡并插好连线。注意:备用的新灯泡必须保存在干燥环境中。
(Last revised: 2003-10-20)
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