主题：【求助】GPC软件测分子量

原文由 robertwg(robertwg) 发表:
谢谢，很好的解释，收获了不少！
我还有一个问题，就是大家有用高温GPC 的么？一般都选什么样的柱子？

很多GPC柱厂家都有高温GPC柱，Waters，TSK，Shodex,PL都有。

非常经典的讨论，顶起。

对离子色谱不是很了解啊

应该是样品和标准样的浓度大高了，不知你进样多少，刚买的色谱柱可能不会过载，但用了一段时间就会过载。我们公司测定时浓度0.5g/L至0.7g/L，用0.3mol/L的缓冲盐做流动相，进样20微升，超过1g/L就会过载。

好像是说重均分子量有15%的误差，这里说是10%的误差，我现在也搞不清到底多大误差才是可以接受的？哪位高手指点一下啊？

原文由 viscotektegent(viscotektegent) 发表:
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对于“Zimm不一定对”的问题我不敢苟同。因为如果Zimm不对，那么Debye更不可能对，Debye是Zimm的变形公式，少了+2A2C.因该说Zimm法使用的局限性较大，而且得到的信息较少。
LSL的愿望是好的，但有些问题我一直没有搞懂：
小角肯定灵敏，但同时噪音也大，所以加了池前的在线过滤，但在线过滤的死体积肯定不比多角度的死体积小。LAL难道不受溶剂扩散的影响么？
高分子样品一般都是多分散的，平均分子量100万的，最高的部分可能有几百万甚至上千万，那低的分子量可能又会很低，如果用大孔的膜，大分子肯定都过去了，但噪音必然升高，影响小分子的检测，，用小孔的膜，那大分子又该如何呢？
作为检测器单纯强调灵敏度其实没有意义，实际的是信噪比。而且池前的在线过滤肯定是一般液相的检测非常避讳的，严重的“修饰”了样品的信号。
剪切作用的影响往往和样品本身也有很大关系。

我确实对生化样品不懂。所以如果你说药典规定用多糖标样，那就没辙了。咱不能跟药典对着干，呵呵。
小角LS噪音大是肯定的，无疑义的。但同时也是有办法解决的！那就是采用了立体取光的原理，而不是像多角法MALS那样是结构简单的平面取光，并且同时还减少了样品池体积，其光路类似和路雪的冰激淋蛋桶，是个圆锥状的，与透射光的夹角是小于10度，7度居多。这样，就可以放过去透射光，从而极大地排除了透射光对小角散射的影响，最大程度地降低了噪音，而同时取光光强却较大，因为立体取光，是取了一圈的光，再到光电二极管等光电转换设备中，再计算等等。这样，小角光散的效果还是非常好的，当然，分子量太小就不行了，而分子量越大越好、越准。
过滤主要是为了滤除未溶解的颗粒杂质，主要是为了保护检测器和管路系统，其作用与进样前的过滤是一样的。这当然有可能把一些没溶解的样品滤掉了，但是那不是仪器的问题，而是样品溶解的问题。如果样品都完全溶解了，过滤是不会影响分析数据准确性的，而且过滤膜尺寸很小、很薄，扩散效应几乎可以忽略不计，在色谱图上也是没有任何影响的。我们的FIPA柱才会看到扩散效应，那是因为柱子很粗，而管路相对很细，使得峰形有些拖尾，但是由于FIPA柱只是把大分子与小分子分开，并不做分子量分布，所以有点儿拖尾也没关系，这个方法主要用于反应釜内的聚合过程监控。而过滤膜是没有这种现象的。
信噪比，其实就是灵敏度。MALS由于要安放很多个取光角，因此使得样品池小不下来，因此样品池很大，而且RI检测器不是专用的，都是从普通液相色谱仪厂家拿来的，因此都是不能承受反压的，所以必须把MALS放在RI的前面，造成了较大的样品池对已经在色谱柱上分离了的样品又进行了一定程度的混合，从而造成了死体积较大，对于窄分布、单分布的样品就会产生较大影响，使得峰形变宽、分子量分布不准确！这可以用传统的单一RI检测器的GPC来验证。另外，MALS还需要较大的光源光强，否则大于90度的角的信号会较弱，而光强越大，噪音也就越大，信噪比就差了，所以灵敏度不足。脱机的多角外推法的光散射仪，光强更大，远大于GPC上用的LS检测器的光强。所以MALS的样品池一般都在70ul左右，而小角的样品池，只有大约18ul。现在，做液相色谱仪的厂家的UV、RI的样品池一般都小于10ul了！光强，MALS一般是LALS的两倍以上。
在线过滤绝不会严重影响信号，因为一般地，溶解后的样品的尺寸远小于过滤膜的孔径！对小分子的、小尺寸的根本不影响。而且，如果使用者觉得有影响，可以不装过滤器不就行了吗。实际上，对于溶解很好、没有杂质颗粒的样品，过滤与不过滤没有区别。而且，做液相色谱仪的几乎都知道，进样前要用0.45u的过滤器过滤啊！对于0.45u的过滤膜，除非样品达到近千万左右的分子量，才会很费劲地进样，一般地，样品在几百万以下时，过滤膜都不会影响样品数据的。而且，不是池前过滤，是柱前过滤。

样品浓度太大，看看柱子有没有说明配多少浓度，我的柱子上标了不同范围的分子量配不同浓度，20万配0.2%。
你的校正曲线不对，你的标样和样品是同一物质，就免去了推导普适校正曲线。但你要标样的分布系数是1.05以内，用峰位分子量和时间作曲线

呵呵 26楼 你说的真是挺棒的，我完全赞同。但是，补充一下，目前已经有厂家的RI检测器是自己生产的、而不是从HPLC厂家拿来，这种特制的RI检测器，是可以承受反压的。而且，如果RI不能承受反压，那么连接三个、四个检测器的时候，特别是有粘度检测器的时候，就应该使用检测器并联配置的方法，这样也可以减少死体积过大对分子量分布数据准确性的不利影响。并联，有专门的硬件，不过对厂家工程师的水平要求稍高一点儿点儿，也不是很难。

澄清几个误区：

1. 多糖有窄分布标样：Pullulan。

2. 多点拟合不一定是直线，和样品的构象有关，所以不一定准。

3. 小于10nm的，多角和两角都得不出Rg，测分子量，一个90度角就够了。

4. 小角的过滤膜可以摘掉。

5. 高分子没那么容易剪切。

楼主的问题，应该就是改拿Mp对RV做标曲，因为软件检测的就是响应最高哪一点的信号；进样量会影响，但是在1-10mg/ml这个范围一般没有，当然这还和色谱柱有关。

GPC误差范围5%，看ISO标准。

很好的交流讨论，学习了；