主题：【分享】什么是高速逆流色谱

说的太简单了，有没有详细的资料啊，发个上来

高速逆流色谱经验分享
-- 文章来源: 丁香园 167

    网友默默躬行：

    高速逆流色谱属于逆流色谱的范畴，逆流色谱是一种新型的分离手段，它的主要分离原理是利用样品在固定相和流动相之间的差异也就是分配比不同而进行分离的，值得注意的是逆流色谱的固定相和流动相都是液体，其主要优点是没有传统色谱的死吸附，样品的回收率高等特点。

    逆流色谱源于逆流分溶法，也就是用实验室经常使用的分液漏斗进行连续的液液萃取，根据样品在两种互不相溶的溶剂中分配比不同而进行分离。

    逆流色谱早期发展的方法有液滴逆流色谱，旋转小室逆流色谱等。但是作为一种分离手段，早期发展的逆流色谱不能满足高效快速的分离，分离的周期很长，效率很低。

    在70年代，Ito 博士成功开发了一种能够高效快速分离的逆流色谱－高速逆流色谱。但高速逆流色谱也有很多种设计，经过几十年的发展，现在的高速逆流色谱一般是采用同步行星式的设计，其主要是利用在高速旋转状态产生的二维离心力场的作用下使两种互不相溶的溶剂快速有效的对流或分割----或者说混合或分层，从而使样品能够在短时间内进行成千上万次萃取，根据样品中的物质分配系数的不同而进行分离的一种方法。

    HSCCC 有几个突出优点：（1）无不可逆吸附。聚四氟乙烯管中的固定相无需载体液-液色谱系统，故而消除了气- 液和固- 液色谱中因使用载体而带来的吸附现象，特别适于分离极性物质和生物活性物质；（2） 高回收率。由于流动相和固定相均为液体，样品可全部回收，分离纯化与制备可同步完成，故特别适于制备性分离；（3 ） 操作简便。因固定相为液体，体系更换与平衡方便、快捷。与HPLC 相比，HSCCC 进样量较大，最多可达数克，是HPLC 的数百倍；与常压、低压色谱相比，HSCCC 的分离能力强，有些样品经一次分离即得到1个甚至多个单体，且分离时间短，数小时即可完成，纯度多在98％以上。

    高速逆流色谱作为一种比较新颖的分离方法，影响因素主要有溶剂体系的选择，旋转速度，流动相的流速，温度等影响。溶剂体系选择即条件的摸索，相当于传统色谱摸流动相的条件，不同的是高速逆流色谱条件的摸索主要是指样品在固定相和流动相两者之间的分配的比值，待分离的样品的K值最好在0.6-1.5范围之内，这样才会有一个好分离效果。转速主要体现在固定相的保留率上，一般转速越高固定相保留率也比较高，分离效果也相对的好一些。流速要适中，太大会降低固定相保留率，太低会容易拖尾。温度是一个非常重要的参数，温度恒定对体系得重复性有着决定性的影响，比如说冬天，夏天可能同一个溶剂体系就会有着不同的分离效果。

    高速逆流色谱在药物领域主要应用在中草药，合成药物，抗生素以及蛋白等领域。在天然产物中应用的更广泛一些，比如生物碱、黄酮、香豆素，蒽醌，皂苷，萜类等都有相应的研究。对于每一类的化合物一般都有一些经典的体系，比如说生物碱用氯仿：甲醇：水（酸水），或者用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水。 在低极性的化合物象挥发油，萜类可以用正己烷：甲醇：水，石油醚：甲醇：水等体系，皂苷一般用乙酸乙酯：正丁醇：水体系。

    以上我介绍了选择溶剂系统的一般步骤，主要是查文献-摸条件-上高速逆流主机-筛选优化体系这几个步骤。摸条件和上机作实验是最关键的。其实每一类型化合物都有一些比较固定的体系，比如说生物碱类化合物你可以用氯仿：甲醇：酸水的体系，也可以用正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水的体系，还有人用正己烷：正丁醇：水的体系成功分离了石杉碱甲。具体哪个体系适合，就要看你样品的具体性质来判定。摸索体系对于初学者可能会比较慢，我觉得慢也不是一件坏事，毕竟是一个经验积累的过程。

    摸索条件主要是判断要的组分的分配系数如何，一般会选在一个比较合适的位置，（0.6-1.5）我们可以通过把体系加入试管当中，然后加入样品，观察上下相的颜色，最好在通过薄层看一下斑点大小（取等量的上下相点板）。

    值得注意的事，选择体系的时候一般要注意最好先选择比较经典的体系或者固定相的保留率高的体系。（判断的一个标准就是上下两相的比重相差越大，保留一般就会高，最好拿个试管看所选体系的分相时间，最好是小于30秒）比如说氯仿：甲醇：水=4：3：2，正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水=1：1：1：1，乙酸乙酯：正丁醇：水=4：1：5体系。氯仿：甲醇：水系统比较适合中等以上极性物质的分离，如果是酸水的话还可以用来生物碱的分离。正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水适合分离低，中等极性的物质，根据化合物不同极性作比例的调整。乙酸乙酯：正丁醇：水主要用一些极性比较大化合物的分离。在选择体系的时候也要注意上下相的比例，一般都是采用轻相做固定相，如果所选择体系上相很多，下相较少的话，就会比较浪费。

    关于体系的优化就是为了寻求一个更好的分离效果，这个相对来说比较容易些，可以根据选择的体系进行比例的调整或者在加入少量的其他溶剂，主要手段就是为了寻求一个更合适的分配系数。除了体系的调整以外还可以进行流速和温度的调整来选择一个比较合适的溶剂系统。

    网友youngsun9802：
    分离皂苷时用的什么溶剂系统，什么检测方式呢？

    我用的是乙酸乙酯：正丁醇：水的体系，连接的检测器是ELSD，象有些皂苷类，甾醇类的没有紫外吸收的，我们一般用ELSD 检测器。

    分离一些水溶性的物质，我们会加入一些正丁醇，由于正丁醇本身的粘度比较大，所以体系会有一些不稳定，我们一般会把流速降低来增加体系的稳定性以求获得好的分离效果。

    如果水溶性更大的，我们可以在体系当中继续加少量的甲醇，来获得一个满意的分配系数.当然分离水溶性的物质我们也可以采用氯仿甲醇水的体系，这个时候甲醇的量应该是比较大的，我看过有体系用氯仿甲醇水分离过黄酮苷类的物质，如果分离效果还不是很明显的，就是说分离物质在氯仿层的溶解度不是很大的话，我们也可以在体系中加入一些少量的正丁醇，调整一下分配系数，这样就会有一些好的分离效果.当然甲醇有的时候也可以换成乙醇，有的时候用乙醇能获得一个比较好的分离效果。

    其实丙酮也能用来分离，但是如果用紫外检测器的话，可能丙酮由于末端吸收会干扰物质的信号在逆流色谱当中用的不是非常多。如果用的检测器是ELSD的话这样丙酮就可以使用。

    网友swjs97：
    HPLC的泵、检测器是否可以和HSCCC联用？主要要考虑的因素是什么呢？

    网友spring000321：
    HPLC的泵理论上是可以跟HSCCC连用的，但要注意，由于HPLC的泵是耐高压的，而HSCCC所用的管材是塑料的，经不起高压，所以在联用的时候一定要注意，不要让管路堵塞了。另外要注意HPLC的泵在不接柱的情况下的泵压，我曾见过有人用安捷伦的泵接HSCCC，结果爆管了，一检查，泵一工作压力就有4MP。

    HPLC的检测器与HSCCC的联用有如下问题要注意，HSCCC上的样品较杂，我们知道，HSCCC的管路直径有1.5厘米，有些许不溶物进入管路不影响分离，但HPLC检测器流通池的容积只有5-8微升，这样就有堵塞的可能，一旦堵塞，要么爆管，要么爆流通池。

    另外HSCCC所用的试剂都是AR的，用HPLC检测器检测灵敏度太高，而HSCCC分离的样品量也较大，HPLC的检测器的量程可能不够。还有就是HSCCC所用的两相溶剂，在运动过程中产生剧烈的混合，因而溶剂不可避免的要产生一些乳化，甚至会产生一些流失，这样HPLC检测器得到的图谱会非常的难看。

    网友默默躬行：
    高速逆流色谱在医药领域的使用范围，总结一下有：

    1、中药领域 （应用比较广泛，生物碱，黄酮，香豆素，糖苷等分离较多，水溶性很大的物质报道的不多）。

    2、抗生素领域，有相关的文献报道。（据我了解，已经有些人在这方面做了很多的研究）

    3、蛋白质类物质，双水相体系分离用逆流色谱分离的文献报导不多。

    这种分类其实是不完全的，因为分离可以应用到很多方面，比如说分离药物代谢产物方面也是一种方向。

    逆流色谱对于制备分离内源性物质也有着自己的优势。因为本身的代谢产物含量少，富集分离困难，高速逆流色谱由于具有高回收率等，样品预处理简单等特点，能够快速的富集到相应的产物，然后再作进一步的分离。

参考书籍：高速逆流色谱分离技术及应用

【内容简介】
高速逆流色谱(HSCCC)技术正在发展成为一种备受关注的新型分离纯化技术，已经广泛应用于生物医药、天然产物、食品和化妆品等领域。本书详细介绍了HSCCC的理论、技术与应用，全书共分15章，第1～4章着重阐述逆流色谱(CCC)基础知识以及HSCCC分离机理、工作方法及溶剂选择策略；第5～8章主要介绍近年来HSCCC发展过程中形成的新技术、新方法，包括分析型高速逆流色谱、双向逆流色谱、pH区带精制逆流色谱、正交轴逆流色谱；第9～15章对逆流色谱技术(主要是HSCCC技术)在各个领域的应用研究成果进行了报道，包括HSCCC在天然植物有效成分、海洋生物活性成分、抗生素的分离中的应用，双水相逆流色谱、离心沉淀色谱在蛋白质等分离中的应用，逆流色谱在手性分离和天然药物工业中的应用。
可供天然产物、中药、药品、食品、化妆品及生物工程等领域的研发人员、技术(分析、分离等)人员使用，也可供高等院校相关专业师生参考。

【目录信息】

第1章逆流色谱基础
11逆流色谱的概念
12逆流色谱的发展
121逆流分溶法
122液滴逆流色谱
123离心分配色谱和螺旋管式逆流色谱
124高速逆流色谱和正交轴逆流色谱
125pH区带精制逆流色谱
126离心沉淀色谱
127螺线形圆盘柱式高速逆流色谱
128逆流色谱的发展趋势
13现代逆流色谱仪器体系
131流体静力学平衡体系
132流体动力学平衡体系
133两种体系的逆流色谱仪的比较
14逆流色谱的基本色谱理论
141溶质的保留
142保留因子和选择性
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【前言】
高速逆流色谱（highspeed countercurrent chromatography, HSCCC）是20世纪80年代发展起来的一种连续高效的液液分配色谱分离技术。它利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现, 因而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品更能反映其本来的特性，特别适合于天然生物活性成分的分离。而且由于被分离物质与液态固定相之间能够充分接触，使得样品的制备量大大提高..

《2006高速逆流色谱应用文献集》 （可免费下载） 
第一部分： HSCCC 综述

•  高速逆流色谱在天然产物分离中的应用

•  逆流色谱技术在抗生素分离纯化中的应用

•  高速逆流色谱在选择最佳溶剂体系的黄金规则和缺陷

•  pH区带精制逆流色谱在中药中的研究进展

• 高速逆流色谱技术在药物研究开发中的应用

• 高速逆流色谱在保健食品功能成分纯化中的应用

• sample capacity in preparative in HSCCC

第二部分：应用文献

A: 中草药领域

a) 制备分离

1 : 系统分离：

运用高速逆流色谱制备分离和纯化何首乌中的化学成分研究

运用高速逆流色谱制备分离和纯化中药虎杖的五种化合物

2: 香豆素，挥发油，内酯类

运用高速逆流色谱制备分离和纯化蛇床子中香豆素成分

运用高速逆流色谱制备分离纯化当归中香豆素组分

运用高速逆流色谱制备分离和纯化白花前胡类香豆素的有效成分

运用高速逆流色谱制备分离和纯化补骨脂中的补骨脂素和异补骨脂素

运用高速逆流色谱分离纯化秦皮中香豆素成分

运用高速逆流色谱分离纯化紫花前胡香豆素成分

运用高速逆流色谱制备分离和纯化百里香中两种香豆素成分

运用高速逆流色谱制备分离姜黄根茎精油中的吉马酮和莪术二酮

运用高速逆流色谱制备分离和纯化木香内酯和去氢木香氢内酯

西瑞香素的超临界流体萃取的正交试验设计，运用高速逆流色谱法从瑞香狼毒中分离7-methoxy-daphnoretin和1,5-diphenyl-1-pentanone

运用高速逆流色谱法从茵陈中大量分离纯化香豆素二甲醚

运用高速逆流色谱法从乌药中分离纯化乌药内酯和钩樟烯醇

高速逆流色谱分离制备川芎油中的Z-藳本内酯和洋川芎内酯A

高速逆流色谱分离制备丹参脂溶性成分



3: 黄酮 类黄酮及黄酮苷

运用高速逆流色谱制备分离和纯化欧亚甘草中的两种黄酮类物质

超临界流体萃取结合高速逆流色谱法从白花败酱草中分离纯化三个二氢黄酮类化合物

运用高速逆流分离纯化金莲花中黄酮苷成分

运用高速逆流色谱一步分离和纯化甘草中的甘草素和异甘草素

运用高速逆流色谱从白花败酱草中分离纯化异荭草苷和异牡荆苷

运用高速逆流色谱制备分离纯化朝鲜淫羊藿中三种类黄酮成分

运用高速逆流色谱从白花败酱草中分离纯化一个新的和两个已知的二氢黄酮类化合物

运用高速逆流色谱分离和纯化中药黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷

运用高速逆流色谱制备分离和纯化知母中的四种化合物

运用高速逆流色谱的梯度洗脱方法从苦参中一步分离纯化3个二氢黄酮类化合物

运用高速逆流色谱的梯度洗脱方法从金丝桃属中分离纯化3个黄酮类化合物和3个间苯三酚衍生物

白花败酱草黄酮类成分的高速逆流色谱快速制备

高速逆流色谱法分离制备淡豆豉中大豆素和染料木素

高速逆流色谱分离纯化木蝴蝶中黄芩素和白杨黄素

荷叶中黄酮类化合物的化学结构鉴定

荷叶提取物的分离和纯化

高速逆流色谱快速分离四种甘草黄酮及其结构鉴定

海洋碳样小单孢菌产生的大豆黄素和染料木素

运用HSCCC-HPLC-DAD法从知母分离芒果苷等

4: 生物碱类

高速逆流色谱法分离附子中的 15-a- 羟基新乌碱

高速逆流色谱分离黄柏中的小檗碱和巴马亭

高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体

高速逆流色谱技术制备石杉碱甲单体（温度考察）

运用高速逆流色谱制备分离和纯化吴茱萸的生物碱成分

运用高速逆流色谱和ELSD联用技术从贝母中分离贝母碱和去氢贝母碱

延胡索中生物碱成分的分离与反相高效液相色谱法含量测定

应用高速逆流色谱技术从延胡索中分离制备延胡索乙素

黄花乌头中Hetisine型生物碱的高速逆流色谱分离与结构鉴定

制备型高速逆流色谱分离中药中的生物碱

运用高速逆流色谱法从黄花乌头中分离纯化生活活性成分

运用高速逆流色谱法从苦参中分离纯化喹诺里西啶生物碱

运用高速逆流色谱法从雷公腾分离4个主要生物碱

运用高速逆流色谱法从延胡索中分离纯化dl-四氢巴马亭



5: 蒽醌，木质素 , 多酚类

运用高速逆流色谱制备分离和纯化大黄中蒽醌类和苯乙烯酸等物质

利用高速逆流色谱分离大黄活性成分

运用高速逆流色谱从南五味子中分离纯化 schizandrin 和 gomisin A

运用高速逆流色谱制备分离纯化去氧五味子素和 γ- 五味子素

利用高速逆流色谱分离茶黄素单体

高速逆流色谱和质谱结合分离鉴定丹参水溶性酚酸的成分

高速逆流色谱分离制备厚朴的有效成分厚朴酚与和厚朴酚

高速逆流色谱法分离制备丹酚酸 B

运用高速逆流色谱从丹参中分离纯化3,4-dihydroxyphenyllactic acid和丹酚酸B

运用高速逆流色谱法从丹参提取物中分离纯化丹酚酸B



6 : 苷类（包括皂苷）

运用高速逆流色谱制备分离和纯化结香中丁香苷和结香苷 C

运用高速逆流色谱从四倍体板蓝根中分离纯化 clemastanin B 和 indigoticoside A

运用制备型高速逆流色谱分离纯化栀子苷

运用高速逆流色谱高回收率的制备分离和纯化巴旦杏中的苦杏苷

HSCCC 法从人参总皂苷中分离制备人参皂苷 Re 与 Rg1

运用高速逆流色谱法从仙茅分离仙茅甙和仙茅甙乙

运用高速逆流色谱法从Scrophularia ningpoensis hemsley分离纯化玄参甙

运用高速逆流色谱法从中草药白术中分离纯化苍术苷和苍术烯丙酯Ⅲ

运用高速逆流色谱法从杜仲树皮中分离纯化松脂酚双葡萄糖苷和鹅掌楸碱

运用高速逆流色谱法从防风中分离纯化 Prim‐O‐葡萄糖基‐Cinmifugin和4′‐O‐β‐D‐葡萄糖基‐5‐O‐Methylvisamminol

运用高速逆流色谱-MS联用技术与TLC-MS联用技术从蒙古黄芪中分离cyclolanostane型皂苷

运用高速逆流色谱法从短葶飞蓬中两步分离野黄芩苷

7: 其他

超临界流体萃取结合高速逆流色谱法从白花败酱草中分离纯化金色酰胺醇酯

运用制备型高速逆流色谱从亚洲柿子中同时制备分离三种三萜烯酸主要活性成分

运用高速逆流色谱和ELSD联用技术从Adenophora tetraphlla（南沙参）根茎中分离化学成分

运用高速逆流色谱法从诃子中分离可水解鞣质诃子酸和诃尼酸

运用微波技术和高速逆流色谱法从当归中分离纯化阿魏酸

运用高速逆流色谱法从太子参中分离纯化 Pseudostellarin B (cyclic peptide)



b) 质量控制

高速逆流色谱与高效液相色谱在中药指纹图谱研究中的比较

丹参的非水毛细管电泳指纹图谱与高速逆流色谱制问题图谱的比较

丹参指纹图谱在高速逆流色谱法和TLC扫描法中的比较

c) 其他

高速逆流指纹图谱中主要活性成分的鉴定

茶黄素单体抑制体内癌细胞的增长研究

运用高速逆流色谱法从白花败酱草叶中分离纯化四个新的和两个已知的异戊烯基黄酮类化合物并考察了化合物的体外抗肿瘤活性

d)立体异构体的分离

运用高速逆流色谱法分离纯化藤黄酸和它的C-2立体异构体

运用高速逆流色谱法从柿子叶中一步分离马尾柴酸和它的立体异构体以及2个五环三萜类酸

B ：抗生素领域

高速逆流色谱法分离纯化环孢菌素

利用高速逆流色谱从真菌HCCB00106转化液分离转化产物

C ：蛋白质领域

高速逆流色谱双水相体系分离蛋白质

高速逆流双水相色谱法纯化卵白蛋白

运用高速逆流色谱从大肠杆菌种的发酵液中一步分离纯化 α- 淀粉酶

---网址
http://www.tautobiotech.com/Tech2.htm

逆流色谱介绍

我们单位有一台,今天打开机箱看到了硬件,跟我想象的还是有很大的判别的,感觉结构上简单了点.与GC和HPLC是没法比的.

谢谢分享

不知现在还有没有人关注此帖啊！
我刚涉足分离行业，对一些分离设备不甚了解，想请教各位：HSCCC中上相和下相与流动相和固定相之间的关系是什么？
假设在分离弱极性物质时，选择石油醚：甲醇：水=2：1：1，那么是说该体系分相后取上相为固定相，下相为流动相吗？还是以石油醚-甲醇-水的不同比例分别作为流动相和固定相（在参考文献时，发现有以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水为溶剂体系，固定相为5：5：5：5的上相，流动相为梯度洗脱：0-100min，5：5：5:5下相；100-250min，5：5:6:4下相；250min以后，5：5：6.5：3.5）？有点糊涂了
希望有人关注啊

高速逆流色谱技术（HSCCC）
高速逆流色谱是一种不用固态支撑体或载体的液-液分配技术，是一种能实现连续有效的分配分离功能的实用分离技术。它由美国国家健康研究院（NIH）的ITO博士于60年代末首创，近年来在天然药物研究领域独显其特色和作用。它能构成连续、自动、高效和非高压的色谱系统，既能实现从微克量级的分离分析到数克上百毫升量级的制备提纯，又能用于未经处理的大量粗制样品的中间级分离以及直接与间接的高纯度分离。该技术仪器设备简单，操作方便，样品无损耗或粘染，溶剂用量少，有利于普及推广，其优点非常适用于中药有效成分的分离纯化。目前，在分离提取天然药物中黄酮、生物碱、蒽醌类衍生物、皂甙等有效成分方面，已获满意结果，若能应用于中成药工业生产，可望解决“要用质量标准不一致的原料，生产出质量标准一致的成药”这一难题。
承蒙longbow瞧的上鄙人，我就跟几帖有关HSCCC的东东，还请longbow多多指教（知你是搞植物化学的，更是景仰）。
一.HSCCC工作原理:设备是有很长的聚四氟乙烯管绕成的色谱柱,当色谱柱作高速行星运转时,互不相溶的两相溶剂在聚四氟乙烯管内作单向性流体运动,让其中一相溶剂作固定相(一般是上相),而流动相则用恒流泵输送穿过固定相,由于样品中各组分在两相中的分配能力不同，导致在色谱柱中的移动速度不一样,因而能使样品中各组分得到分离.
二.HSCCC的两大突出特点:1.聚四氟乙烯管内的固定相不需要载体，因而消除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象，特别适用于分离极性物质和具有生物活性的物质;2.分配分离是在旋转运动中进行,两相溶剂都被剧烈振动的离心力甩成极微小的颗粒，样品各组分在两相微粒的极大表面上分配,并且能在颗粒振动与对流的环境中有效的传递,是一个成千上万次的连续萃取过程,特别适用于制备性分离.
三.HSCCC的局限性:1.分离效率比不上气相色谱和HPLC技术,不适宜用它去完成组分复杂的混合物的全谱分离分析.2.这一点，詹天佑(HSCCC中国鼻祖)认为HSCCC的分离柱容易做的容积大些,因而样品负载力也大，通过我们HSCCC产业化,我认为,不是很现实,就是说HSCCC的进样是有限的.
四.HSCCC的发展:HSCCC的基本模型早在20世纪60年代就由Dr.Yoichiro Ito创立，近20年，HSCCC进入了在世界范围内的推广应用阶段。每年一度的美国匹兹堡国际分析化学与应用光谱学学术会议上，都设有专题组。2002年4月在北京召开HSCCC第二届国际学术会议，会议的主题突出天然产物的研究和开发。1978年，周海钧教授建议研制该设备并配合我国的抗生素质检工作；1980年，我国研制出了第一台并用于抗生素检定；此后，国内的研究者（詹天佑、蔡定国、肖蓉等）发表了大量的用HSCCC分离天然产物（中草药）的论文，奠定了我国在这一应用领域的国际领先地位。
五.HSCCC的设备类型:快速分析型HSCCC、半制备型HSCCC、PH区带制备型HSCCC、两维制备型HSCCC、三维制备型HSCCC以及四维制备型HSCCC等
六.HSCCC服务中药现代化的设想:
1.配合中药质量检定,制备高纯度的药用成分标准品或参照物
2.在中药一类新药开发中，逐步分离制备活性成分,配合活性成分跟踪
3.配合中药新药申报,制备必需的高纯度指标成分和必需控制的杂志成分
4.配合中药指纹图谱的建立，分离有关组分,以提供更丰富和准确的数据
5.针对有高纯度等级要求的药用天然产物原料的生产需要,扩大生产规模,搞产业化,我们正致力于此
6.建立中药活性成分数据库,为中药新药研发提供物质基础
7.配合大孔吸附树脂层析、CO2超临界萃取等分离技术,可以实现产业化
HSCCC在植物有效成分分离中的应用（一）生物碱
生物碱是植物中一类重要的化学成分，已知的生物碱种类至少有2000种以上，到目前为止，HSCCC研究天然产物化学成分也以生物碱的研究报道最多。
正丁醇-丙酮-水（8：1：10）从委内瑞拉的箭毒中分离马枯素和Panarine；正丁醇-氯化钠（0.1mol/L)（1：1）从Strychmos usambarensis(马钱科）的树干和树皮中分离10-羟基-Nb-甲基-柯楠醇；用四氯化碳-甲醇-水（20：20：2）从Anisocycal cymosa的根中分离得到一个季铵盐生物碱和5个叔苄异喹啉生物碱；用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3：7；5：5）从粉防己根中分离粉防己碱、去甲粉防己碱和轮环藤酚碱；用氯仿-磷酸盐（0.07mol/L PH6.4)(1:1)从唐古特山莨菪粗提物中分离出了四个生物碱；从小蔓长春花植物的叶子中用正己烷-乙醇-水（6；5：5）体系分离长春胺和长春辛；分别用正己烷-乙酸乙酯-乙醇-水（6：3：2：5）和正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水（1：1：1：1）从红豆、杉的粗提物中分离纯化了紫杉醇、cephalomannine、巴卡亭Ⅲ；以石油醚（bp.40~60℃）-乙酸乙酯-甲醇-水（50：70：80：65）分离得到了紫杉醇和cephalomannine。还有学者对苦参、洋金花、千里光、三尖杉等植物的总碱中应用HSCCC分离得到了单体生物碱。Ito于1994年研发了PH区带HSCCC，是HSCCC的突破，它使植物的分离提取达到了克量级。
二.黄酮类
黄酮类是一类比较重要的植物化学成分，很多的植物活性成分是黄酮类化合物。用氯仿-甲醇-水（4：3：2）分离芫花总黄酮的各组分；氯仿-甲醇-水（6：3：2）从大黄提取物中分离出大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚等；从山楂叶中用氯仿-甲醇-水（5：4：2）分离各组分，该类化合物，众多的研究者都把注意力放在氯仿-甲醇-水系统上。
三.萜类
植物中的某些色素、挥发油、树脂等类型成分，大多属于该类化合物。有人从青蒿素中纯化了Artemisinin,实验以异辛烷-乙酸乙酯（7：3）为固定相，甲醇-水（6：4）为流动相；以氯仿-甲醇-水（9：12：8）分离龙胆根的甲醇提取物得到一个裂环烯醚萜甙；用氯仿-甲醇-异丁醇-水（7：6：3：1）分离积雪草，得到了积雪草甙。
综上所述，HSCCC在天然产物中的分离制备是很成功的，有理由相信，HSCCC已为天然植物的分离制备开辟了一个十分广阔的天地。
利用HSCCC建立中药指纹图谱，中药现代化的一个重要内容，就是要做到中药的质量可控，对于中药或者中药复方里每个成分及其之间的相互作用机理不是十分清楚的情况下，中药材及中成药指纹图谱质控技术对于保证中药的质量，促进中药的现代化有着十分重要的作用，已成为牵动中药业全面进步的关键技术，它对保证中药功效，提高中药工业整体水平，带动重要产业现代化，推进中药走向世界，具有非常重要的意义。HSCCC技术具有很好的分辨率，且重现性好。中药提取物经HSCCC所得到的逆流色谱图都有2~3个以上的组分峰，不但可以用于中药有效成分的定性或定量分析，若能进一步深入研究，整理出某一中药的特征峰和指纹谱，指定标准图谱，可以用于中药的质量控制和测定。在高速逆流色谱指纹图谱研究方面，目前已对大黄、沙棘、何首乌等一些中药进行了研究。
让逆流色谱技术为中药现代化服务

摘 要：逆流色谱技术是一种新颖的分离技术。它是不用任何固态支撑体的液液分配层析法，则能够完全排除支撑体导致的不可逆吸附和对样品的玷染、失活、变性等影响，能实现对复杂混合物中各组分的高纯度制备量分离。本文概述了这一技术的特点、发展简史和应用情况，并就中药成分高纯度标样的制备、新药研究、高质量中间体生产和生产过程的质控等问题，对如何使此项技术为中药现代化服务提出了建议。 　逆流色谱技术 Countercurrent Chromatigraphy（CCC）是当今国际分离科学技术的一个新颖的分支。它的突出特点是在用很长的软管（如聚四氟乙烯管）绕制成的色谱柱内不加入任何固态支撑体或填料。使用时由使用人根据被分离混合物的理化特征，选择某一种有机／水两相溶剂体系或双水相溶剂体系，此体系可以是二元的或多元的。用此体系的上层或下层作为色谱过程的固定相，首先将其注满管柱内，然后让此管柱作特定的旋转运动，用由此形成的离心力场来支撑住柱内的液态相。这时，若用溶剂体系中的另一层作为流动相，带着混合样品由泵的压力推入分离管柱，样品就会穿过两个液相对流的整个管柱空间，各个组分也就会按其在两相中的分配系数（即某一组分在流动相中的溶解度同它在固定相中的溶解度的比值）分离开来。
　　一、逆流色谱技术的特点
　　1．逆流色谱不用固态支撑体，完全排除了支撑体对样品组分的吸附、玷染、变性、失活等不良影响。所以，能避免不可逆吸附所造成的溶质色谱峰拖尾现象，能实现很高的回收率。例如，对于黄酮等易被填料吸附的物质的分离与制备就具有明显的优势。
　　2．逆流色谱的分配分离是在旋转运动中完成的，两相溶剂都被剧烈振动的离心力场依其界面特征见成极微小的颗粒，样品各组分会在两相微粒的极大表面上分配，并且能在颗粒振荡与对流的环境中有效地传递。所以，它就象是把通常的溶剂萃取过程成千上万次地、高效地、自动连续地予以完成。
　　3．没有填料在柱内的占空体积，逆流色谱的分离柱又容易做得容积大些，柱内空间全部是有效空面。所以，它的样品负载能力很强，制备量较大，而且重视性很好。
　　4.逆流色谱不用填料，分离过程不是淋洗或洗脱过程，而是对流穿透过程。所以，能节省昂贵的材料消耗和溶剂消耗，运行使用的后续投入较低。
　　逆流色谱的分离效率比不上气相色谱和高效液相色谱等技术，不适宜用它去完成组成复杂的混合物的全谱分离分析。而它对于样品预处理条件的放松，以及它的回收率高，制备量大的优点，作为特定部位和特定组分的分离纯化与制备则是十分可取的。
　　二、逆流色谱技术的发展概况
　　逆流色谱的基本模型早在20世纪60年代就由Dr．Yoichiro Ito创立，经过数10年在美国国家健康研究院刚（NIH）的实验室研究，特别是在近20年，高速逆流色谱技术（High－Speed CCC，HSCCC）的出现，使它进入了在世界范围内推广应用的阶段。每年一度的美国匹兹堡国际分析化学与应用光谱学学术会议上，都设有CCC的专题组?quot;Journal of Chromatography"、"Journal of Liquid Chromatography"等重要学术刊物曾多次出版这一技术的论文专辑。近10年间，HSCCC在生物化学、医药学、农业、环境、材料、化工、海洋生物以及无机离子等众多领域的成功应用，使之成为一种引人注目的技术手段。1996年，在美国由John Wiley＆Sons，Inc出版了《High－Speed Countercurrent Chro－matography》一书，笔者应邀撰写了该书的HSCCC onMedicinal Herbs一章，此书被选编为著名的分析化学丛书第132卷，作为一项新技术向世界传播。2000年9月，逆流色谱技术国际委员会在英国Brunel大学召开了此技术的第一届国际学术会议CCC－2000，笔者参加了会议的组织领导工作并作了天然产物分离纯化方面的特邀报告。受该国际委员会的委托，我们将于2002年4月在北京召开此项新技术的第二届国际学术会议，CCC－2002将突出天然产物研究与开发的主题。
　　1978年，当时任我国卫生部药品生物制品检定所所长的周海钧教授，从世界卫生组织的资料中获知Dr．Ito正在美国NIH研究开发实现逆流色谱的设备，并已用于抗生素异构体的分离。周先生建议笔者研制此种设备以配合我国的抗生素质检工作。1980年，我们研制出了我国第一台逆流色谱仪，并由检定所抗生素室用于抗生素成分的分离与分析检定。在蔡定国教授等植物药学专家的帮助与合作下，完成了首批生物碱、黄酮等类中药成分的分离应用研究，其结果引起了国内外的关注。这些工作，确立了我国在CCC技术及其应用研究方面的国际领先地位。1987年，笔者应美国NIH邀请，赴美同Dr．Ito合作从事CCC技术及相关生物工程技术的研究，共同推进了HSCCC技术的发展并获得美国发明专利。在美期间，笔者还同蔡定国教授、中国医学科学院药物所方起程教授、华西医科大学药学院肖悼英教授、肖蓉教授等密切合作，发表了一批用HSCCC分离制备天然药物活性成分的论文，为形成我国CCC技术在这一应用研究领域的国际领先优势和技术特色打下了基础。近10多年来，我国关于CCC技术的研究开发工作始终同天然产物（如中草药和农产物）的研究开发工作密切地结合着。
　　三、逆流色谱技术为中药现代化服务的设想
　　我们经过20余年的科研实践，已经建立了具有自主知识产权的快速分析型HSCCC、半制备型HSCCC、两维制备型HSCCC、pH区带制备型HSCCC和大分子蛋白质分离用的CCC等系列化的技术成果。应用这些技术成果，我们开发出了数10种常用中草药和茶叶等农产品中数百种单体成分的分离纯化与制备的工艺技术。这些成分包括黄酮类、生物碱类、蒽醌类、皂苷类、大环内酯类、多酚类、儿茶素类、多糖类、糖蛋白类等等不同类别的物质。例如对于银杏黄酮苷元、异鼠李素、山柰酚、茶叶中儿茶素ECCE、ECC、GCG、红豆杉中紫杉醇及其类似物、白藜芦醇和白藜芦醇甙、番茄红素等等，都已建立了制备纯度达到98％以上的工艺技术。
　　不论是从中医药的理论基础和思维体系，还是从中药的功能主治和临床效果来看，中药都不会象西药那样采用单纯的成分入药。我们利用先进的技术，制备药物中活性部位和活性成分的主要目的是一种技术表达，绝不是企图违背中药的辩证与协同的根本法则。恰恰相反，我们希望利用这一手段，从标准物质、检定方法、活性研究、功效阐述、生产和产品的质量控制等方面，去演绎中医药的精髓，丰富国际交流和促进理解的技术语言，推动传统中药的科学化和现代化。
　　我国正在中药行业推广CO2超临界萃取、大孔树脂层析和膜分离等技术。逆流色谱技术同前三者比较，其制备规模较小，但是选择性和分离、分辨能力较强。因此，逆流色谱可以作为前三者的后续步骤，用以完成进一步的分离纯化。美国NIH曾经支持过这样一个技术方法学的研究课题，即是针对象紫杉醇等价值较高的物质的分离制备，采用CO2超临界萃取做前期提取，高速逆流色谱做分离纯化，高效液相色谱做最终的分离分析与鉴定。以这样的技术架构，来表达一种天然纯净的、高回收率低消耗的、高效率的技术制程。 
　　1．配合中药质量检定，制备高纯度的药用成分标准品或参照物。
　　2.在高类别中药新药的研发中，逐级分离制备活性部位或活性成分，配合活性跟踪与入药部位的设计。
　　3．配合高类别中药新药申报工作，制备必需的高纯度指标成分和必需控制的杂质成分。
　　4．配合中药材和中药方剂指纹的建立，对其中某些组分或组分群进行分离制备，以提供更丰富和准确的信息和数据。
　　5.针对有较高纯度等级要求的药用原料的生产需要，扩大制备规模，建立逆流色谱中试生产技术体系。
　　6．配合中药生产中原料-加工-成品的质量控制工作，探索快速简便的质控新方法。
　　7．积累和建立中药活性部位或活性成分的分离纯化工艺技术数据库，为新一代的中药新药研发提供物质的和技术的支持。
　　结语
　　逆流色谱技术本身还在发展，还有不少问题有待研究和改进。从国际范围来看，也还未见将此项技术直接引用于某一特定的产业。但是，近年来的应用结果和发展趋势表明，这一新兴技术将会在天然产物的相关产业中展现良好的应用前景。我国中医药的渊源与优势、我国中药的丰富资源以及中药中物质组合的特征，似应成为关注和吸引逆流色谱技术的基础。如果我们能花一些力气，在国际上率先将这一新技术的研究与应用同中药现代化的宏伟事业结合起来，对于科学技术的进步、对于中药科研和产业的发展，似是有所裨益的。