主题：【原创】【迎奥运活动四】兴奋剂的检测

兴奋剂检测是一项难度很高，责任十分重大的工作。其难度表现在以下几个方面：
（1）药物及其代谢物的种类多，变化大，禁用的百余种药物以原体或一个或多个代谢产物的形式存在与人体体液中，因此，需要检测和确证的化合物多达几百种。除此以外，用药后的不同时间，这些化合物的浓度不断的发生变化，直到排出体外。

　　（2）药物在人体体液中的浓度很低，药物在人体体液中的浓度常常是豪微克（即十亿分之一克）或更低的水平，因此对检测的灵敏度要求很高。打一个比方，如果在一个25*50m的标准游泳池中加入一勺糖，要求在池子的任何一处都可以测到糖的存在。

　　（3）要求准确的定性和定量，不能有丝毫的疏漏和差错。性奋剂的检测工作对运动员的运动寿命负有法律责任。检测者要对每一种药的药物代谢动力学及光普分析有全面娴熟的了解及足够的分析参考资料。所以，要准确的定量及判断是否超出了允许的水平，是一项难度较大的工作。

　　检测的主要体液是尿液，但对个别单纯用尿液检查难以确定结果的物质目前正在探索采用血样分析来予以弥补。

　　（1）尿样检测：尿样检测是兴奋剂检测的理想样本。其优点在于：取样方便；对人无损害；尿液中的药物浓度高于血液中的药物浓度；尿液中的其他干扰少。

　　分析大体分筛选和确认两个过程。筛选即对所有的样本进行过筛，当发现某样本可疑有某种药物或其代谢产物时，再对此样本进行该药物的确认分析。在进行药物的确认分析时，尿样要重新提取，此提取过程与空白尿（即肯定不含有此药物的尿液）和阳性尿样（即服用过该药物后存留的尿样）同时进行，以保证确认万无一失。

　　分析过程中按药物的化学特征和分析方法将所有药物分成四类，即：第一类：尿中以游离形式排泄的易挥发性含氮化合物（主要是刺激剂）；第二类：尿中以硫酸或葡萄糖醛酸结合的难挥发性含氮化合物（主要是麻醉止痛剂，beta阻滞剂和少数刺激剂）；第三类：化学结构和特性特殊的刺激剂（咖啡因，匹莫林）和利尿剂；第四类：合成类固醇及睾酮。

　　尿样进入实验室，首先进行尿样ph和尿比重测定，然后按以上四类药物分成四组进行筛选分析，主要是化学提取和仪器分析两步，最后由计算机打出检测报告。

　　（2）血样分析：血样检测的目的主要是补充尿样分析方法的不足，目前尚处于研究探索阶段，目前仅用于血液回输，红细胞生成素，生长激素，绒毛膜促性腺激素，睾酮等的测量。

兴奋剂检测技术-酶联免疫分析
酶联免疫（ELISA）的基本原理有三条：


（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；


（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；


（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。


ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面： 1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。 2、研究抗酶抗体的合成。 3、显现微量的免疫沉淀反应。 4、定量检测体液中抗原或抗体成份。


方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
　　

1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。
　

　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
　

　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
　

　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。
　　

5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
　

　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。


方法二　用于检测未知抗体的间接法：


用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml， 每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。
↓
加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)
↓
于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。
↓
其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

摘要：兴奋剂作为以提高比赛成绩为唯一目的的不正当手段，在竞技体育中的滥用与危害日渐严重，也引起了人们的极大关注。本文对运动兴奋剂的种类与制定方法进行了简要的概括，并系统地介绍了一反兴奋剂为目的的兴奋剂检测技术的原则，以及该领域国内外的研究进展与今后的发展方向。



1  兴奋剂的种类与判定原则

1.1    提高运动成绩的辅助手段与兴奋剂的判定

1.2    兴奋剂的分类

2          兴奋剂的检测

2.1    检测样品的来源

2.1.1        尿样

2.1.2        血样

2.1.3        头发

2.2    兴奋剂的筛查范围

2.3    检测技术

2.4    检测结果的可信度和法律效应

2.5    兴奋剂检测方法的具体要求与原则

3  结语


兴奋剂与兴奋剂检测

兴奋剂检测-放射免疫分析基本原理
RIA是把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种超微量物质的测定方法。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法的灵敏度高达ng甚至pg水平。测定的准确性良好，ng量物质的回收率接近100％。本法特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。

    RIA的基本原理，是利用标记抗原(xAg)和非标记抗原(Ag)对特异性抗体(Ab)发生竞争性结合。竞争结合反应可用下式表示：
*Ag  +  Ab←→*Ag-Ab
+
Ag
↓↑
Ag-Ab
    在上述反应系统中，当只有xAg和Ab时，只产生xAg-Ab复合物，并保持可逆的动态平衡。如反应系统中同时加入Ag，因Ag与xAg免疫活性完全相同，故与Ab具有相同的亲和力。当xAg为一定量、Ab为有限量、Ag与xAg的量之和超过Ab上的有效结合位点时，xAg-Ab复合物的生成量与Ag的量之间呈一定的函数关系。即当Ag量少时，Ag-Ab生成量少，而xAg-Ab生成量增多，游离的xAg减少。可见xAg-Ab
复合物生成量是受Ag含量制约的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同浓度的标准物和一定量的xAg及限量的Ab反应，采取一定方法将结合相(B)与游离相(F)分开，即可算出该标准物在各浓度下xAg-Ab复合物的结合百分率(B／T)。

    这一反应过程，可用以下简图说明。图中黑圈表示标记抗原，白圈表示非标记抗原，长条代表抗体，每个抗体有两个结合位点，标记抗原与非标记抗原对抗体有同等的结合能力。



放射免疫分析原理示意图

从图中可见，当标记抗原与抗体量一定时，结合率(B／Bd--F)随待测样品中抗原量增加而降低。在实际工作中，以B／T的值为纵坐标，标准物的浓度为横坐标，绘成曲线，即竞争性抑制曲线，或称准确曲线。将未知浓度的样品按同样条件操作，所得结合率(％)与标准曲线相比，即可查出样品中待测抗原的浓度。
    放射免疫分析典型的操作程序是首先配制一系列已知浓度的标准溶液，并各取一定体积；于其中加入一定量的标记抗原和特异性抗体；在一定条件下使之反应平衡后，采取适当方法将B与F分离；分别测量其放射性；绘制标准曲线。对样品中抗原的测定，则可在同样条件下操作，在标准曲线上查得含量。


标准曲线
左：横坐标为等份刻度；右：横坐标为对数刻度

重组人生长激素与胰岛素样生长因子-1是目前运动员滥用严重而又难以检测的内源性激素类兴奋剂。人生长激素是由垂体前叶分泌、含有191个氨基酸的肽类激素，具有广泛的生理作用，是强有力的合成代谢促进剂。IGF-I主要由肝脏合成且高度依赖hGH，介导hGH的多数生长和代谢功能。rhGH与IGF-I的促进生长和增大肌肉体积和力量的生理作用诱使某些运动员开始将其作为兴奋剂使用。二者均被国际奥委会列为违禁药物。

绿色荧光蛋白融合技术在激素类兴奋剂检测中的应用

兴奋剂检测中生物技术
兴奋剂检测，难度高，责任重大。首先，违禁药物及其代谢产物的种类多，变化大，禁用的百余种药物以原体或一个或多个代谢产物的形式存在与人体体液中，需要检测和确证的化合物多达140种。其次，药物在人体体液中的浓度很低，用药时间的长短也影响这些化合物的浓度变化，直到排出体外，要检测出尿液中纳克（即十亿分之一克）或更低的水平的代谢产物，准确的定性和定量，对检测的灵敏度要求很高。再者，部分禁用药物本身也是人体内源成分，需要在极其微量之中区分内源和外源之别，难上加难。

　 随着奥运会的临近，许多陈年兴奋剂丑闻再度浮出水面，索普、乌尔里希、兰迪斯，琼斯，格林，这些曾经显赫辉煌的名字如今都被打上了一个个问号。这不禁让人产生联想——北京奥运会将如何保证公平公正的比赛环境？奥运会不仅是体育水平的较量，也是一个国家科技水平的展示。在奥运会赛场外进行的这番较量中，中国人如何向世界显示自己的实力？带着这些问题，生物通记者采访了创建中国反兴奋剂中心创建人之一，中国药学发展奖药物分析奖获得者：王慕邹教授。

　 王教授深情回忆起1986年到1989年期间，为迎战1990北京亚运会，在只许成功不许失败的巨大压力下，药物所毅然接过了兴奋剂检测中心筹建项目，仅用3年时间，和体委的同志一起，在药物所大院墙根边的简陋房子里，从无到有，从一片空白中建立起一个国际奥委会8次检查全部一次通过的A级兴奋剂检测实验室。如今的迁往奥运会新址的中国反兴奋剂中心早已今非昔比，连续16年通过国际反兴奋剂组织的考试，水平和设备已经是国际一流水平。

　 国家体育总局运动医学研究所副所长、中国反兴奋剂检测中心副主任吴侔天表示“2008年北京奥运会的兴奋剂检测的重点是提高常规检测灵敏度的技术，以提高检测的准确率和简化教程。”据报道，2004年雅典奥运会上就有几名国外运动员在自己国内未被检测出来，但到雅典就被检测出呈阳性的事件。这就是国家自己的检测系统灵敏度不够，给了运动员一个错误的信息。要保证2008年中国代表团在家门口比赛不出服用兴奋剂的丑闻，就必须提高常规检测的灵敏度，改进自己的检测方法。虽然这不是突破性的技术，但却可以保证中国代表团真正实现公平、公正、公开的体育精神。

　　另外一个问题是检测速度。如果金牌都发到运动员手中了，检测结果才发现运动员服用违禁药品，会让本来庄严的奥运会变得有些像闹剧。2000年悉尼奥运会虽然解决了通过血检的方法检测EPO，但这种方法准确率不高，还需要通过尿检来确定，但尿检的过程太复杂，共有187个步骤，且都需人工完成。如何简化这个过程，如何准确高效地检测，成为2008年北京奥运会迫切需要解决的问题。

当前兴奋剂检测主要靠液相和气相色谱仪来分离和筛查样本中的化学成分、常规质谱仪筛查化合物的质谱指纹图，必要时通过高分辨质谱来进行确认和定量。王教授介绍说，20年前的兴奋剂检测还只靠液相和气相色谱，以及气相色谱-质谱联用，不挥发的成分还难以检测，内源性和外源性的激素类物质的分辨还需要通过相当复杂的计算；如今即将迎战北京奥运会的中国反兴奋剂检测中心，为应对史无前例的4500例奥运会兴奋剂检查，不仅配备了当年尚未成熟的液相色谱-质谱联用，还配备了更高效更强大的武器：高分辨磁质谱和同位素质谱。

先进武器

　　尿检取样后，尿样进入实验室经过pH值和尿比重测定，首先是按四类大药物分成四组对所有的样本进行筛选分析。要在短短10多天的时间内准确筛选分析至少4500例样本，中国反兴奋剂检测中心此次专门购入的赛默飞世尔科技全新TSQ Quantum Access三重四极杆液质联用系统以应对数以千计的复杂而多样的样品和巨量检测任务。新设备可同时提供定量分析和被测物离子谱图进行化合物鉴定，其优化的离子源离子化更彻底，有效提高检测灵敏度和耐受性；加上样品通量高，选择性高，速度快时间短，稳定性好，还特别加强了定性能力，扩展了可分析成份的质量范围, 可对超过300种不同被测物进行多化合物扫描，进行多组分筛选分析同时进行定量和结构确证，使之更能适应在兴奋剂检测的苛刻要求----多达140种违禁药物及其各种代谢产物的快速筛选检测需求。

　 快速筛选中一旦发现有阳性结果的样品，即需要马上进行该药物的确认分析。如果说前面的筛选分析结果阳性只有7成把握，那么后面的确认分析就必须准确定性和定量，保证99%以上的准确性。要知道，一旦公布兴奋剂检测结果阳性，运动员可谓身败名裂，运动生涯，荣誉，前途，统统灰飞烟灭，准确可靠的检测结果，其重要性不言而喻。在万众瞩目的奥运会赛场上，检测结果更加不容差池。

　 为此，中国反兴奋剂检测中心虽然已有MAT95高分辨率质谱和Delta同位素质谱，为北京奥运会还专门从赛默飞世尔购入更加强劲的武器：最先进的DFS GC/MS高分辨磁式气相色谱和质谱联用仪和Delta V GC/MS/IRMS同位素质谱系统，以承担2008北京奥运会反兴奋剂确认分析的任务。

DFS高分辨双聚焦磁质谱不同于以往型号的高分辨磁质谱仪，采用了最新的离子光学理论，是15年来第一台完全新型的双聚焦质谱仪。DFS新颖的磁场和电场分析器设计提供目标化合物的最高灵敏度，常规分析飞克数量级(10-15)目标化合物轻而易举。DFS高分辨率质谱仪灵敏度一直居于行业领先，超过其他同类产品８～９倍， 可轻松应对尿检中少至纳克级甚至更低的代谢产物的准确定性和定量，更大程度保证定性和定量检测结果准确性。高度自动化程度，大大减少人为操作误差的可能。为了提高检测中心在奥运期间的工作效率，应对大批样品的检测任务，北京反兴奋剂检测中心采用了赛默飞世尔独有气相色谱-高分辨率质谱联用技术，为DFS高分辨磁质谱还专门配备了2台气相色谱作为“助手”，通过二台气相色谱交替为ＤＦＳ高分辨率质谱仪提供样品，节省了气相色谱走完程序升温后必须冷却才能为下一个样品进样的准备时间，从而提高了工作效率。

还刘国梁清白 同位素比质谱立大功
睾酮是最常见的类固醇兴奋剂之一，睾酮的检测比较麻烦，不论男女尿中都有内源性睾酮排出，兴奋剂检测中对是否滥用睾酮的检测主要依据尿液睾酮和表睾酮的比值(T/ET)来间接地判断运动员是否使用过睾酮(T/ET>4即为阳性)。瑞典卡罗琳斯卡学院的燕妮•雅各布松•舒尔茨博士和她的同事在《临床内分泌学和代谢》杂志上发表的一份调查报告显示，UGT2B17基因编码的酶可控制睾酮葡萄糖酸苷（简称TG）的生成，而在携带2个正常UGT2B17基因的个体中14%的人不用服任何禁药检测结果已经超标，携带失活UGT2B17基因的人有一半即使按标准剂量服用外源激素后依然可以蒙混过关。违禁药物中不少成分属于内源性激素或多肽，如何准确区分内源性和外源性激素，这对兴奋剂检测技术提出非常高的要求。

　 北京反兴奋剂检测中心为此专门配置的高灵敏度的DELTA V 同位素质谱仪能达到前所未有的高灵敏度。同位素比质谱在分辨内源性和外源性激素上有无可比拟的优势，可辩别出尿中的睾酮是内源分泌的，还是外源加入的。准确率接近100%，DELTA同位素比质谱仪在过去的兴奋剂检测中可立过大功。

　 1999年马来西亚世乒团体赛发挥失常的刘国梁在男团决赛中输掉2场比赛而导致中国队痛失的男团冠军奖杯。有消息称刘国梁失常原因是因为早前单项赛中兴奋剂检查阳性，一时闹得满城风雨。乒乓球是中国的骄傲，难道大国手也要靠兴奋剂？作为中国人简直难以接受。直到2000年乒协正式澄清，刘国梁在1999年荷兰举行的世乒赛单项赛上尿样检测中表睾超标。表睾本身对运动员的能力没有任何影响，是一种睾酮类固醇激素的掩盖剂，幸亏借助同位素比质谱，包括洛杉矶大学实验室在内的多家国际一流的兴奋剂检测中心对刘国梁的尿样进行了多次检测，最终得出的结论是刘国梁表睾超标是自源性的，即其自身基因内分泌的结果，与违禁药物无关。若非同位素比质谱立功，说不定我国乒坛就要无辜折损一员勇将，今天优秀的国家队教练员中也许会少了刘国梁大名了。

　 清者自清，浊者自浊。同样是睾酮检测，去年环法自行车赛又出兴奋剂丑闻，位于夏特奈的法国反兴奋剂实验室使用DELTA同位素比质谱仪对意大利车手莫雷尼的尿液进行了检测，发现检测出的睾酮并非莫雷尼自身产生的，而是服用了合成睾酮。莫雷尼被车队开除并被勒令退出此次比赛。

　 有了高科技助力兴奋剂检测，赛场上的公平才有了坚实的科技基础。
　
六、基因兴奋剂
遗传突变打造冠军
连续3届奥运会成为芬兰英雄的越野滑雪运动员门蒂兰塔先后共获3枚奥运金牌和2银2铜，世锦赛2金2银1铜，赛后发现其血液中红细胞数目比其他人高20%以上，30年后，科学家在调查了门蒂兰塔家族多达200人的血液样本后发现，包括门蒂兰塔在内的50多人携带促红细胞生成素基因突变，使他体内红细胞数比正常人多20％，供氧更充分而使他在比赛中滑雪速度快、耐力持久。这，我们称之为“运动天赋”。

人造天赋
　 2004年美国宾夕法尼亚大学Sweeney等人发表文章，通过在小鼠骨骼肌中表达胰岛素样生长因子（IGF-1）可在不影响其他组织器官的情况下增加小鼠骨骼肌20%-50%，肌力也大大增强，且不影响血液循环中的IGF-1水平而产生其他危险。该成果有望用于治疗重症肌营养不良患者。由于外源基因进入体内后的表达产物和自身表达产物均可视作内源而无法区分，用于运输基因的AAV病毒载体也是人体常见的携带病毒，因而可能成为最隐蔽的兴奋剂。文章发表后作者收到大量来自病人和健康运动员的咨询。

随着生物技术的突飞猛进，以基因疗法的方式改造遗传背景、改造血液和改造肌肉，提高力量和耐力爆发力，人造天赋在理论上已经没有什么不可能了。实际上,基因研究和体育的关系越来越紧密。迄今已发现100多个与增强肌肉和肺活量有关的基因。新一代测序平台将人全基因组测序的成本降到6万美元以下，解析优秀选手的基因,比较其碱基对和正常人的差异，已经不是天方夜谭。但是，针对基因兴奋剂的检测方法还没有定论。

但是，早在1990年开始备受追捧的基因疗法，目的是通过转基因的方式将外源基因导入携带严重基因缺陷的病人体内，以期修复原来缺陷的基因，表达原来缺失的蛋白产物。基因疗法既有成功治疗重症单基因缺陷患者的记录，也因为转基因载体导致患者治疗基因缺陷的同时却患上癌症而遭受重大挫折。这种原本用于造福带有严重基因缺陷病人的新技术，依然还在重重挫折和困难中艰难前进的时候，却也许会被毫无保障的用于健康的年轻生命上以谋取荣誉和利益，这无疑是生物技术发展下的意外副产物。

　 基因兴奋剂已经被列入世界反兴奋剂组织的违禁名单中，但是目前尿检和血检均不能有效查出，相关的兴奋剂检测方法还有待开发。高科技的发展一方面不停地给兴奋剂检测提供最先进的“武器装备”,另一方面也不断给反兴奋剂斗争增加难度。2004年后有大量的媒体报道“基因兴奋剂可能挑战北京2008奥运”，是否会成为现实？我们不得而知。

小鼠要登珠峰 基因兴奋剂检测新动向

生物通最新的消息是美国著名的宾夕法尼亚大学受反兴奋剂委员会和核酸纯化领域著名的QIAGEN公司赞助联手研究检测基因兴奋剂的方法。按照计划，将让活的小鼠登上珠穆朗玛峰，检测在在珠峰的极端条件下缺氧促进EPO生成时的分子特征，以研究天然条件下和基因兴奋剂条件下诱导产生的分子的异同。

“在相关问题搞清楚之前,谈基因兴奋剂的检测不太现实。”国家体育总局运动医学研究所副所长、中国反兴奋剂检测中心副主任吴侔天表示，不到北京奥运会开幕,不能排除有新检测项目的可能性。但是毫无疑问，生物技术在这赛场外的兴奋剂和反兴奋剂之间的较量中，扮演了最主要的角色。

　 世界一流的A级反兴奋剂检测实验室，世界一流的仪器装备，久经考验的最勤奋的工作人员，2008北京奥运会赛场之外的较量，即将开战，让我们拭目以待

兴奋剂广泛应用于人类哮喘和心脏病的治疗 。在高于治疗剂量长期服用时 ,能使饲养动物提高瘦肉率，导致饲养者经济利益的提高。但是激素类药物存在着潜在的生理毒性，因此使用受到国际社会的限制。β-兴奋剂口服方式具有活性，

适宜掺和于动物饲料中。家畜体内积累β-兴奋剂最多的组织是内脏、视网膜、尿、

毛发也能反映身体信息。β-兴奋剂按其化学结构式可以分为苯胺类和苯酚类两种。两种β-兴奋剂，对苯胺类回收率高的测定方法，对苯酚类却不尽然。反之，亦然。过去，兴奋剂的检测方法多集中在克伦特罗苯胺类单一成分的测定上，

现在人们致力于探索多组分同时测定的方法。各种方法的分歧在于样品的前处理步骤和最终的仪器检测方式。本文通过参阅国际上该方面的研究工作，按测定对象和样品种类的不同加以综述 。

    第一部分 样品的前处理

    第二部分 检测和确证方法


β-兴奋剂的检测方法概述

摘要：应用气相色谱 - 质谱(GC-MS)联用技术建立动物组织中β2—兴奋剂的测定方法。动物组织加 1 %的高氯酸溶液匀浆 ,用乙酸乙酯:异丙醇(6∶ 4)萃取 ,经固相萃取柱净化 , BSTFA + 1 %TMCS衍生后进行 GC-MS测定。样品中最低检出浓度分别为特布他林0.5 μg/kg、克伦特罗1.0μg/kg、沙丁胺醇0.2μg/ kg。



　　检测β2—兴奋剂ELISA、 HPLC、 HPLC 2MS、 LC2MS、 GC2MS几种方法,ELISA用于样品中β2—兴奋剂筛选 ,不能确定何种β2—兴奋剂 ,且试剂盒对不同β2—兴奋剂响应值相差很大;HPLC-MS仪器价格贵; GC-MS灵敏度、分辨率高 ,常用于兴奋剂残留的测定。本研究采用 GC-MS方法对常见且有代表性

的沙丁胺醇 ( Salbutamol) 、克伦特罗 (Clenbuterol) 、特布他林(Terbutaline) β2—兴奋剂进行检测 ,对动物组织中三种β2—兴奋剂进行同时提取、净化 ,然后用 GC-MS法对其进行定性、定量进行研究 ,从而建立动物组织中β2—兴奋剂多残留检测技术平台 ,现报告如下。


[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Mp]气相色谱- 质谱法测定动物组织中的β2—兴奋剂含量[/url]

芯片毛细管电泳激光诱导荧光快速分离检测麻黄碱类兴奋剂

摘 要：研究用芯片毛细管电泳激光诱导荧光检测系统分离测定经 72 chl oro2 42 nitrobenzo2 22 oax2 1, 32 diazole(NBD2 Cl) 衍生的麻黄碱和伪麻黄碱的实验条件。采用胶束毛细管电动色谱分离体系 ( 12 mmol /L S DS + 10mmol /L硼砂缓冲液 , pH 9.0) ,在 45 mm长的通道上实现了麻黄碱和伪麻黄碱的快速分离 ,一次分离小于 1 . 5min。10～100 mg/L范围内 ,峰高与浓度呈良好的线性关系 ,麻黄碱、伪麻黄碱的检出限分别是 0.83 mg/L和1.10 mg/L。所建立的方法应用于尿中麻黄碱和伪麻黄碱的分离测定 ,取得满意的结果。



  1　引 言

  麻黄碱 ( ephedrine, EP)和伪麻黄碱 (p seudoephedrine, PEP)是一类拟肾上腺素药 ,具有松弛平滑肌、 收缩血管、 兴奋中枢神经等作用。在临床上常与消热解痛药一起用于治疗感冒。它们也常被滥用为竞技体育的兴奋剂 ,已被国际奥委会列为违禁药物。尿样中 EP类药物常用 GC、 HPLC等方法测定 ,但是分离时间较长。毛细管电泳分离检测 EP类药物所需时间较短 ,但用 UV检测灵敏度较低。Chen等将流动注射在线试样预富集与毛细管电泳联用 ,使联用系统对 EP的检测限达到 12 mg/L,成功应用于药代动力学研究。最近 , Zhang等用荧光试剂 72 chl or o2 42 nitrobenzo2 22 oxa2 1, 32 diazole (NBD2 Cl)柱前衍生 ,毛细管电泳激光诱导荧光法测定了中药中的 EP和 PEP,提高了检测灵敏度。芯片毛细管电泳与常规毛细管电泳相比 ,具有分析速度快、 仪器易于微型化等优点 ,适合现场的快速检测。本研究建立了 NBD2 Cl衍生、芯片毛细管电泳分离、激光诱导荧光检测尿液中 EP和 PEP的快速分析方法。

芯片毛细管电泳激光诱导荧光快速分离检测麻黄碱类兴奋剂