主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之十）

放射免疫法(RIA)测定动物组织中玉米赤霉醇的残留物(EEC ,筛选法)
Method For Measurement Of Residues Of Zeranol In Animal Tissure By Radioimmunoassy （EEC, Cy 1.6 Screening Method）


1. 引言
欧盟各国禁止在动物源食品中使用玉米赤霉醇，对进口的和欧盟成员国生产的动物产品中玉米赤霉醇的残留量规定为零。

2. 应用范围
本分析方法描述了食品和动物源样品中玉米赤霉醇总量的测定。本法适用于肉、鱼和生物材料如动物器官、生物体液和粪便。按空白样品测定的标准差三倍计，玉米赤酶醇的检测限为0.1 - 1 g/kg或0.1 - 1 g/L。

3. 参考文献
Commission Decision,93/256/EEC,laying down the methods for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action.〔OJ. №L.118, 14.4.93. pp 64-74〕

2052/VI/84-EN File 6.21 Ⅱ-4, Scientific Veterinary Committee, Working Group – “Reference Methods for Residues ”, General Criteria for the establishment of reference Methods for the Detection of Residues.

ISO Standard 78/2-1982 Layout for standards – Part 2:standard for Chemical Analysis

Methods based on modifications of methods described by:-

Dixon, S.N. and Russel, K.L.(1983), Radioimmunoassay of the anabolic agent zeranol.Ⅱ. Zeranol concentrations in the urine of sheep and cattle implanted with zeranol (Ralgro). J.Vet. Pharmacol. Therap. 6.173-179.

Dixon,S.N. and Mallinson, C,B.(1986) ,Radioimmunoassay of the anabolic agent zeranol.Ⅲ. Zeranol concentrations in the faeces of steers implanted with zeranol (Ralgro). J.Vet. Pharmacol. Therap. 9, 88-93.

Dixon, S.N. and Russel, K.L.(1986), Radioimmunoassay of the anabolic agent zeranol.Ⅳ. Zeranol concentrations in the tissues of sheep and cattle implanted with zeranol (Ralgro). J.Vet. Pharmacol. Therap. 9.94-100.

Determination of zeranol in bile by HPLC/RIA. (1989). Central Veterinary Laboratory, Surrey,KT15 3NB.

Other references:
Bates,M.L., Warwick, M.J. and Shearer, G. , (1985) Determination of synthetic growth promoters in bile. Food Add. Contaminants, 2, 37-46

Duchatel, J.P., (1985),Free and conjugated zeranol residues determined by radiommunoassay in urine and plasma of calves treated with Forplix. ANN. rech. Vet. 16, 93-97

4.定义
玉米赤霉醇含量是指按本法测得的样品中所含玉米赤霉醇的量，不管其化学形式如何。含量以 g/kg或 g/L表示。

5.方法提要
本法包括6/7个步骤
-- 组织样品在缓冲液中均质或生物体液用缓冲液稀释
-- 用酶对缓冲/均质液进行共轭水解
-- 有机溶剂提取玉米赤霉醇
-- Sep-Pak C18小柱（可选）净化
-- HPLC对玉米赤霉醇进一步净化
-- 最终用RIA测定
-- 采用标准曲线外推法计算玉米赤霉醇含量，并用玉米赤霉醇的回收率进行校正，特别是动物组织样品。

6.动物组织样品的提取试剂
引用的试剂可保证实验结果，其它来源试剂可相当。
6.1 用于所有动物组织
6.1.1 丙酮
6.1.2 干冰
6.1.3 乙醚（无过氧化物，高纯），甲基-叔丁醚可替代乙醚
6.1.4 重蒸馏水。
6.2 用于肝、肾、胆汁和尿液的试剂
6.2.1 磷酸缓冲液pH 7.0（如6.5.4）
6.2.2 β-葡萄糖苷酶(例如,),用10倍体积的重蒸馏水稀释。该酶工作在pH7.0
6.2.2.1 质量控制尿液或胆汁：取自使用玉米赤酶醇的牛。
6.2.2.2 质量控制尿或胆汁：取自未使用玉米赤酶醇的牛。
6.3 用于肌肉和粪便的试剂。
6.3.1 氯仿
6.3.2 1 mol/L NaOH.
6.3.3 90% HAc
6.3.4 甲醇
6.3.4.1 甲醇:水 = 60:40 (v/v)
6.3.4.2 甲醇:水 = 30:70 (v/v)
6.3.5质量控制粪便：取自使用玉米赤酶醇的牛。
6.4 用于测定肌肉、肝、肾和脂肪样品的试剂。
6.4.1 3H-玉米赤霉醇回收率溶液：将贮备液(6.5.6.1)蒸发并用缓冲液（6.5.4）重新溶解制得，临用前配制。
6.4.2 质量控制
6.4.2.1 质量控制1：肌肉，肝、肾和脂肪，取自未使用玉米赤霉醇的牛。
6.4.2.2 质量控制2：肌肉、肝、肾和脂肪，取自使用玉米赤霉醇的牛。
6.5 用于RIA操作的试剂。
6.5.1 标准玉米赤霉醇的甲醇溶液（6.3.4）贮存于4℃中

数量 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pg/0.1mL 0 25 50 75 100 150 200 300 400 600 800 1000

6.5.2 适宜与1.5 mL水溶液混合闪烁液,例如:4.5g, 2,5-二苯恶唑(PPO),(例如Hopkin/Williams闪烁级),500mL曲通X-114(例如Koch Light闪烁级), 1.5mL甲苯(6.5.9)。
6.5.3 活性炭悬浮液 - 5g活性炭(例如: Norit-A), 0.5g葡聚糖(例如Pharmacia T70)。用1升重蒸馏水配置。
6.5.4 磷酸盐-明胶缓冲液 - 4.68g无水NaH2PO4，8.66gNa2HPO4，9.0g NaCl ,0.1g thionersal (例如 BDH)或1.0g叠氮化钠,1.0g 明胶(例如 BDH),用重蒸溜水配置成1升溶液,贮存于4℃中。
6.5.5 玉米赤霉醇标准液制备。
6.5.6 3H-玉米赤霉醇溶液贮存于-20℃中。
6.5.6.1 用甲醇稀释溶液(6.5.6)，使3H-玉米赤霉醇浓度为1 uCi/mL,-20oC中保存。
6.5.6.2 3H玉米赤霉醇测试液，通过对贮备液（6.5.6.1）的挥发，并用缓冲液（6.5.4）溶解。得到活度为10000 cpm/0.1mL。当天配制。
6.5.6.3 必需测定3H-玉米赤霉醇非特异性结合(NSB),如果超过3H-玉米赤霉醇总计数的10％，则必须再经纯化或更换。
6.5.7 玉米赤霉醇抗血清贮存于-20℃中（见13节）。
6.5.7.1 用缓冲液（6.5.4）配制抗体溶液（按照抗体配制说明操作），缓冲液中抗体的浓度应大于最终RIA保温混合物浓度（见9.5.2.1 - 9.5.2.3）的7倍。
6.5.8 硅化液
6.5.9甲苯

7.仪器设备
7.1液体闪烁计数仪，配有自动样品更换。
7.2匀质机 (Silverson型)
7.3冷藏空间
7.3.1冷藏室/冰箱空间。
7.3.2深度冷冻仪，-20℃
7.4通风橱
7.5离心机
7.5.1冷冻离心机
7.5.2台式离心机
7.6加热器
7.6.1 37℃水浴/保温箱
7.6.2 40℃/45℃水浴
7.6.3 110℃烘箱
7.7玻璃器皿
7.7.1试管75mm×16mm
7.7.2锥形离心管
7.7.3通用瓶，25mL带螺旋盖
7.7.4硅化试管(7.7.1)通过用硅化液浸润，然后在100℃烘箱中烘1小时硅化。
7.8闪烁瓶
7.9旋涡混合器
7.10移液器和配量器。
7.10.1半自动移液枪。
7.10.2巴氏移液管。
7.10.3斜度测量(乙醚，10mL和5mL)。
7.10.4用于闪烁剂配量器。
7.11具有吹氮和蒸发集管的蒸发仪。
7.11.1蒸发仪的冷却附件，保证蒸发温度不超过50℃。
7.12磁力搅拌器。
7.13量筒，25mL。
7.14 HPLC仪。参阅公司或产品资料，相当型号或产品均可。
7.14.1进样阀(Reodyue,7125型)配备0.25ml样品定量管。
7.14.2 HPLC泵 (Waters 510型或LKB 2150型)。
7.14.3 UV检测器，可变波长或波长为254或240nm (Waters 440型)。
7.14.4馏分收集器(LKB Redirac型)，见注释2。
7.14.5 HPLC柱: Hypeosil ODS （150mm 4.6 mm I.D. 5 m）(Chrompack)或CP微珠C18 （100mm 4.6mm I.D. 3 m）(Chrompack)
7.14.6记录仪/打印机

8. 样品和采样步骤
注意事项见6.3.1节和ISO文件78/2-1982。下面注释源于2052/VI/84-EN的附录II。
8.1样品性质：样品应符合64/433/EEC指令所规定的测定肉中残留物的要求。生物体液或粪便也可作为
残留物检测的样品。
8.2样品数量：样品数量必须满足本法测试以及重复分析所需的量。本法样品数量不得少于：
肉、肝、肾、脂肪，20g；粪便，10g；血液，20mL；尿液，5mL；胆汁，1mL
8.3样品取样和包装必须适合在实验室能清楚的识别。
8.4包装，保存和运输必须保持样品的完整性，不能对检测结果产生不利影响。
玉米赤霉醇的样品在保存和运输中温度应低于-18℃。