主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之九）

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发表于：2008/11/26 07:37:23 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

动物组织中伊维菌素残留量的测定(EEC 确证法)

Determination of Ivermectin at Residue Levels in Animal Tissues
(EEC,Cy4.4, Confirming Method)

注意安全操作

引言
 对家畜（包括牛、羊、猪、马）和人类内外寄生物，伊维菌素是一种广谱和强力的杀灭药剂，可按原药口服，也可作为制剂灌服。通常剂量按每公斤体重计算为0.2-0.6mg/kg 。
欧共体制定了伊维菌素在动物性食品中最高残留限量：15μg/kg（肝），乳中不得检出（0μg/L）。

1. 主题内容
 本分析方法用于动物组织样品中伊维菌素总残留量的测定。

2. 应用范围
本方法可作为确正法用于检验牛肉、牛肾和猪肾中伊维菌素残留量，本方法测定低限是2μg/kg。

3. 参考文献
Commission Decision,93/256/EEC,laying down the methods for deteeting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action.［OJ.No L.118,14.4.93 PP64-74］
2052/VI/84 File 6.11 II-4,Scientific Veterinary Committee,Working Group-“Reference Methods for Residues”,General Criteria for the establishment of Reference Methods for the Detection of Residues.
Iso Standard 78/2-1982 Layout for standards-Part 2:Standard for Chemicd Analysis MAFF,1989,Determination of Ivermectin at residue levels in animal tissues.Food Science Laboratory,Colney Lane,Norwich.Standard Operating Procedure.
Nord lander,I.and Johnsson,H.(1990).Determination of Ivermectin residues in swine tissues-An improved clean-up procedure using solid phase extraction.Food Addi t,Contamin.7,79-82.
Tway,P.C.,Wood,J.S.and Downing,G.V.(1981)Determination of lvermectin in cattle and sheep tissues using high performance liquid chromatography with fluorescence detection.J.Agric,Food chem. 29 ,1059-1063.

4. 定义
本检测方法所测得的伊维菌素残留量是指被测物质中伊维菌素的量，无论其以何种化学形式存在，检测结果以μg/kg或mg/kg表示。
5. 方法提要
本方法由6个步骤组成：
——在缓冲液中使样品均质；
——用有机溶剂萃取；
——用反相C8柱进行萃取；
——衍生化；
——在固相柱中净化；
——用带有紫外荧光检测器的高效液相色谱仪测定；
——用标准曲线内插法计算伊维菌素的残留量，对动物组织样品，应用伊维菌素的回收率加以校正。
6. 化学试剂
6.1 试剂
6.1.1 三氯甲烷
6.1.2 三乙胺
6.1.3 甲基咪唑()
6.1.4 甲醇：重蒸馏
6.1.5 醋酸酐
6.1.6 乙腈
6.1.7 二甲基甲酰胺()
6.2 溶液
6.2.1 三乙胺和乙腈的混合水溶液：在300mL乙腈中加入1mL三乙胺，加水定容至1L。 6.2.2 衍生化试剂混合物：将甲基咪唑、醋酸酐和二甲基甲酰胺以2：6：9的体积比
混合。临用前配制，每次用衍生化试剂使用100μL。
6.2.3 液相色谱流动相：将30mL甲醇加入到970mL水中，混合减压过微孔滤膜，进行减压脱气。
6.3 标准溶液
6.3.1 伊维菌素标准是由Merck、Sharpe、Dohme公司提供。
6.3.2 伊维菌素标准储备液：取10mg伊维菌素标准品，用甲醇溶解，并用甲醇定容
于100mL，此储备液存放在4℃下，可以放置两周。
6.3.3 中间标准液：吸取4mL标准储备液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，存
放于4℃，可放置两周。
6.3.4 标准工作液：吸取5ml中间标准液于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，此
溶液中伊维菌素的浓度为0.2ng/μL，每天使用前必须重新配制。
6.5 样品添加方法 
向5g样品中添加50μL和125μL标准工作液中，放置15min。

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2008/11/26 7:37:39 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器
7.1 500mL离心管。
7.2 100mL玻璃烧杯。
7.3 孔径为47mm的玻璃微孔过滤器。
7.4 25mL玻璃样品瓶。
7.5 50mL梨形瓶。
7.6 带有聚四氟乙烯螺旋帽的3mL玻璃反应器。
7.7 1mL和10mL的玻璃注射器。
7.8 Ultra-Turrax均质器。
7.9 混合器(旋涡)。
7.10 旋转蒸发器(水浴40℃)。
7.11 自动进样用的小样品瓶。
7.12 2mL玻璃瓶。
7.13 离心机。
7.14 超声波浴。
7.15 200 μL和1000μL可调移液管。
7.16 带有加热装置(40℃)的多孔通氮蒸发器。
7.17 膜微孔过滤器，不锈钢，孔径13mm。
7.18 滤膜，直径13mm和47mm。
7.19 固相萃取装置。
7.19.1 真空歧管Vac-Elut。
7.19.2 C8/500mg净化小柱。
7.19.3 sep-pak硅胶净化小柱。
7.19.4 柱型净化小柱组合装置
7.19.5 净化小柱用50mL洗脱液贮存器
7.20 HPLC-LKB 2150泵
色谱柱：10cm×3mm(内径)chromsep(chrompack)柱是由5μm的Hypersil ODS装柱，保护柱10mm×2.1mm(内径)是由pellicular(30-40 μm)反相装柱。
流动相的流速0.4mL/min，荧光检测器是Perkin Elmer LS4,其激发波长364nm，发射波长470nm，缝宽10nm，量程范围是4.0单位。
使用电子积分器(spectra physics 4290)记录色谱并积分，用Waters Wisp712进样阀进样25μL。

8. 样品和取样程序
注：注意事项见6.3.1和ISO文件78/2-1982
以下注解选自2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
8.1 样品属性：样品应符合64/433/EEC指令中规定的测定肉和奶中残留物的要求。
8.2 样品量：样品量必须满足检验和复验对样品量的要求。本方法中牛
肉、羊肉等的取样量不得少于30g。
8.3 样品的保存和包装应符合在实验室中能正确识别的要求。
8.4 包装、贮存、运输时必须保持试样的完整性，不能影响检测结果，用于分析伊维菌素的试样必须在-18℃以下贮存和运输。

9. 测定步骤
9.1 取5g精细切碎的样品加入15mL乙腈，放入超声波水浴中超声3min，然后均质
2min，在每分钟5000转下离心5分钟。
9.2 将上清液转移到存有40mL水和0.05mL三乙胺的烧杯中，搅拌混匀。
9.3 依次用5mL乙腈和5mL三乙胺/乙腈混合水溶液(6.2.1)淋洗C8键合柱.
9.4 将提取液转移到已经调好柱头和贮液器的Bond-Elut柱中,在排出提取液后(柱子不能干)，再用5mL乙腈洗脱，洗脱液收集到玻璃样品瓶(7.4)中。
9.5 用乙腈分两次每次2mL,将洗脱液转移到50mL梨形瓶中。
9.6 于40℃水浴中用旋转蒸发器浓缩有机相至干。
9.7 加入1mL甲醇溶解残渣。
9.8 绘制校正曲线
为制作范围为0-5μg/kg的校正曲线, 在9.7这个步骤（9.7）进行标准添加实验。

工作标准液（6.3.4.）μL 甲醇（μL）伊维菌素浓度μg/kg
0 1000 0
25 975 1
50 950 2
75 925 3
100 900 4
125 875 5

9.9 将500μL试样(9.7)T提取液移入反应瓶中，样品在这一步可以存放在-20℃以下。否则要通过在氮气流下蒸发至干，除掉甲醇。
9.10 加入100 μL混合衍生物(6.2.2)，扭紧瓶盖，轻轻摇匀。将反应瓶放入95℃烘箱中1小时。
9.11 将冷却后的样品加入3-4mL三氯甲烷，然后定量转移至10mL注射器中，再注射到sep-pak硅胶柱(7.19.3)上，样品通过柱体，将提取液收集到50mL梨形瓶中，然后再用9mL三氯甲烷冲洗柱体，将冲洗液收集于同一梨形瓶中。
9.12 于40℃水浴中用旋转蒸发器蒸出三氯甲烷。
9.13 将粘稠残留物用0.5mL甲醇移出，通过0.45μm的微孔过滤器后移入1mL的注射器中，将样品收集于一自动进样用玻璃瓶中（7.11）。
9.14 取25 μL进行液相色谱分析。

10. 结果计算
10.1 建立峰高对标准物浓度的校正曲线。每次注入样品中伊维菌素的量由测定的峰高来计算。然后这个数据用进样体积和平均回收率%(由添加样品计算)修正以得到浓度(mg/kg)。进样25μL标准液相当于0.25g样品。
伊维菌素的保留时间7分钟左右。
回收率(%)= 检测出的伊维菌素量 ×100
添加的伊维菌素量
样品中伊维菌素浓度(mg/kg)=μg伊维菌素(从校正曲线得到) × 1 × 100 1000 0.05 回收率（%）
对于那些伊维菌素含量超出标准曲线范围的样品，将提取液稀释后进行色谱检测并进行适当的体积修正。
10.2 灵敏度
本方法的测定低限是0.002mg/kg
10.3 质量控制方法
10.3.1 确正
6个空白样品添加相当于2μg或5μg/kg伊维菌素，连续三天内每天进行分析，每批确正实验由下列样品组成：
2个空白。
2个2μg/kg标准添加液添加到空白样品提取液浓缩残渣。
2个5μg/kg标准添加液添加到空白样品提取液浓缩残渣。
6个添加2μg/kg或5μg/kg的样品。
分析样品的回收率应为70-110%，批内和批之间的CV值应当在5-15%。

11.特殊情况

12.方法注意点

13.样品控制
每天每批分析16-20个样品，每批样品应包含9-13个未知样品，另加上样品添加的质量控制样品。空白样品由以前分析的样品得到，保证不含伊维菌素。

14.实验报告

15.缩略语表（略）

16.流程图
组织样品加入乙腈均质 C 8柱


计算结果 HPLC Sep-pak硅胶柱衍生化

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