主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之二十）

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发表于：2008/11/30 07:47:33 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效液相色谱法测定牛、羊、猪的肌肉及小牛肌肉、肝、肾和脂肪中庆大霉素和新霉素的残留量 EEC (筛选法
Gentamicin and Neomycin-Routine Screening Method for the Determination by HPLC in Muscle of Cattle, Sheep and Pigs and in Muscle, Liver, Kidney and Fat of Veal Calves (EEC Sg3.6.)
安全操作注意事项及急救在检验中使用所有有机溶剂都必须按危险品处理，所有操作都必须在通风柜中进行。
1. 溶剂、酸、碱接触皮肤后，必须用大量冷水冲洗，溅进眼睛后，必须用水冲洗并立即进行医务处置。
2. 割伤、划伤—立即进行医务处置
3. 烧伤和冻伤—烧伤在凉水，冻伤可在微热水中浸10min后，立即进行医务处置。
引言
目的
检测牛、羊和猪组织中庆大霉素和新霉素残留量与欧盟86/469/EEC指令相一致。
背景
庆大霉素和新霉素是具有广谱抗菌效果的动物用药。庆大霉素由三种主要成分组成，即C1、C2、C1a它们具有相同的抗菌效果。
1. 主题内容
该分析方法使用在药物系分析化学实验室（B.P.403, 54001 Nancy, Cedex-France）,测定可食用动物组织中庆大霉素（3个组份）和新霉素的残留量。
2. 应用范围
该法可用于猪、羊、牛样品中庆大霉素和新霉素残留量检测，经认可后也可用于其它样品检测。庆大霉素最小检测限为50ng/g肌肉和脂肪;100ng/g肝和肾。新霉素最小检测限为50ng/g肌肉。
3. 参考资料
93/256/EEC委员会决议，拟订的检测荷尔蒙或甲状腺拮抗素残留物的方法。
ISO标准78/2-1982标准制定—第二部分，化学分析标准。
Sar. F. Nicolas, A and Archimbault P.（1993）开发和优化液相色谱法测定牛组织中庆大霉素含量，Anal. Chim. Acta. 275,285—293
4. 定义
按该法测定的是动物组织中庆大霉素和新霉素的残留量其测定结果表示为 g/kg.
5. 方法提要
该方法由5步组成
—匀浆；
—以5%三氯乙酸沉淀蛋白；
—以CM一交联葡萄糖柱净化样品；
—HPLC柱后衍生化；
—内插法计算结果。
6. 仪器及试剂
注意：在方法中所引用的试剂（包括仪器）的产地、型号是适用的，其它产地、型号试剂（仪器）可等同使用，所有试剂必须是分析纯以上。
6.1 化学试剂
6.1.1 EDTA（Merck）
6.1.2 乙腈
6.1.3 樟脑磺酸钠（Aldrich）
6.1.4 邻苯二醛（Fluka）
6.1.5 硼酸（Merck）
6.1.6 NaOH
6.1.7 乙醇
6.1.8 硫酸庆大霉素（药效相当于620 g/mg）（Virbac SA，Carros, France）
6.1.9 新霉素（Bayer）
6.1.10 双蒸馏水（HPLC用水须经超声脱气5min可在24小时内使用）
6.1.11 2-巯基乙醇（Aldrich）
6.1.12 Brij-35（聚氧乙烯-23-月桂酯）（）
6.1.13 三氯乙酸
6.1.14 CM-交联葡萄糖 C-25（Pharmacia）
6.1.15 叠氮化钠
6.1.16 Na2SO4
6.1.17 亲水棉（药典级）
6.1.18 1mol/L HCl
6.1.19 K2HPO4
6.1.20 甲醇
6.2 标准溶液
所有标准溶液都保存在冰箱中
6.2.1 标准贮存液
6.2.1.1 称取162.1mg庆大霉素溶于100ml水中，保存在聚丙烯瓶中，保存期一个月。
6.2.1.2 称取320mg新霉素溶于100ml水中，保存期一个月。
6.2.3 工作标准溶液和肌肉、肝和肾添加溶液浓度：以1mmol/L EDTA稀释液配成0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0 g/mL。
6.2.4 脂肪添加溶液浓度：以乙腈/1mmol L-1 EDTA混合液（6.2.3）配成与6.3.2相同浓度的添加溶液。
6.3 有关溶液
6.3.1 1mmol L-1 EDTA：称取372mg EDTA（6.1.1）溶于700mL水中，并稀释至1L。
6.3.2 1mmol L-1 EDTA/乙腈（1：1 v/v）。
6.3.3 5%三氯乙酸：称取50g三氯乙酸（TCA）（6.1.13）溶于600ml水中，并稀释至1L。
6.3.4 EDTA/TCA：称取372mg EDTA（6.1.1）溶于1L 5%TCA溶液中（6.3.3）。
6.3.5 EDTA/0.2mol L-1 Na2SO4/叠氮化钠：称取28.4g Na2SO4（6.1.16）和200mg叠氮化钠溶于1L EDTA溶液中（6.3.1）。
6.3.6 0.1mmol/L缓冲溶液，pH7.0：称取14.2g Na2SO4和17.4g K2HPO4溶于700ml水中，调pH=7.0，并定容至1L。
6.3.7 0.5mol L-1樟脑磺酸钠：称取12.7g樟脑磺酸钠溶于水中并定容至100ml。
6.3.8 HPLC流动相：称取12.7g樟脑磺酸钠（6.1.3）溶于100mL 1mmol/L EDTA溶液中（6.3.1），加入500mL脱气蒸馏水，以盐酸调pH=2.2，以脱气蒸馏水定容至1L。与甲醇以55：45（v/v）比例混合，经0.2 m微孔滤膜过滤备用。
6.3.9 OPA溶液：称取5.3g硼酸（6.1.5）至250mL容量瓶，加入7.5ml 30% NaOH溶液和200mL脱气水（6.1.10）及0.2g邻苯二醛溶于10mL 95% 乙醇后的溶液、0.5mL 2-巯基乙醇和1mL 30% 聚氧乙烯-23-月桂酯溶液（6.1.12），最后以脱气水定容至250mL。此溶液保存期24小时。
6.3.10 HPLC系统冲洗溶液：300mL甲醇与200mL脱气水混合溶液。

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2008/11/30 7:48:28 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

7. 仪器设备
7.1 冷冻离心机（Jouan CR422）
7.2 40mL特氟隆离心管
7.3 超声波（L&R 140S）
7.4 2mL玻璃瓶及盖
7.5 0.3mL HPLC瓶及盖
7.6 全玻璃过滤器（滤纸直径47mm）（Millipore UK Ltd）
7.7 Virtis匀浆器（Virtis Model 45）
7.8 50mLVirtis玻璃管
7.9 分析天平
7.10 天平准确度0.1g
7.11 涡漩混匀器
7.12 磁力搅拌器
7.13 绞肉机
7.14 50，100，250，1000mL容量瓶
7.15 4℃冰箱
7.16 0.2，0.5，1.0mL吉尔森移液器（Gilson Pipetman）
7.17 pH计
7.18 巴斯德吸管
7.19 巴斯德吸管胶皮球
7.20 0.2 m尼龙滤膜
7.21 高效液相色谱仪
—泵：附脉冲膜阻止器Spectroflow 400二元泵（Foster City,USA）
—进样器：自动进样器（Model 507 Beckmann）配100 l进样管
—检测器：Shimadzu RF-551荧光检测器，配150W短弧氙灯，激发波长340nm，发射波长440nm，设灵敏度为“high”档，增益为“1”
—柱：125mm×4mm i.d. Lichrospher 100 RP-18，5 m，柱两头加塞置45℃恒温箱中保存，
柱子每周运行一个溶剂梯度再生起始甲醇/H2O(6.3.10)15min内至100%甲醇并保持15min，冲洗流速1.2mL/min，进样300次后换新柱；
—使用与HPLC泵相似的泵和一个死体积小的三通管（Model 5-8283; Supelco, St. Germain-en-laye, France）添加OPA溶液（6.3.9）完成柱后衍生化反应；
—衍生化反应在特氟隆管状反应器（3m×0.5mm i. d.）（Model 5-9206, Supelco）中进行，反应器温度45℃，OPA流速为0.5mL/min；
—流动相流速1.2mL/min；
—保护柱：4mm×4mm i. d.（进样100次后更换）。
8. 样品和取样程序
有关要求引自ISO文件78/2-1982 6.3.1节及2052/VI/84-EN附录Ⅱ。
8.1 样品的性状，样品应符合64/433/EEC指令中测定肉中药物残留的要求；
8.2 样品量，样品量应满足测定方法及复验所需量的要求；
8.3 样品保存和包装应达到在实验室中能正确辨识的要求；
8.4 样品的包装、保存和运输方法应能满足样品保持原始性和完整性的要求，不能影响检测结果的判断，分析庆大霉素和新霉素的样品应在低于-18℃的条件下运输和贮存；
9. 测定步骤
9 .1 样品制备
样品应按批检验，控制样品应用添加方法检测限浓度的测定。
9.1.1 样品先进行解冻，然后绞碎。
9.1.2.1 称取5 0.1g绞碎样品置50mL Virtis管。
9.1.2.2 称取5 0.1g空白样品置50mL Virtis管。
9.1.3 添加500 l添加溶液（6.2.3或6.2.4（脂肪））置空白样品中（9.1.2.2），放置平衡30min。
9.1.4 加20mL TCA/EDTA溶液（6.3.4），用带U-形刀的匀浆器匀浆10min。
9.1.5 将匀浆物转移至特氟隆离心管（7.2）在5℃，8000rpm（7000g）条件下离心15min。
9.1.6 将上清液倾入一个50mL容量瓶中。
9.1.7 以30% NaOH调pH=7.0 0.1后，以pH7.0缓冲溶液（6.3.6）定容至50mL。
9.2 柱净化
9.2.1 柱制备
称取5g CM-Sephadex C-25交联葡萄糖（6.1.14）于Na2SO4/EDTA/叠氮化钠溶液（6.3.5）中浸泡过滤，在巴斯德吸管中塞入棉花（6.1.17）后，装添1mL浸泡后的交联葡萄糖，以Na2SO4/EDTA/叠氮化钠溶液（6.3.5）洗涤（2×1mL）备用。
9.2.2 取10mL萃取液（9.1.7）以每次1mL的速度注至柱中，以2×1mL Na2SO4/EDTA/叠氮化钠溶液（6.3.5），1mL H2O（6.1.10）和250 L 0.05mol L-1NaOH溶液依次过柱。
9.2.3 以1mL 0.05mol L-1NaOH 溶液洗脱庆大霉素和新霉素，并加压赶尽所有洗脱液。
9.2.4 加100 L 1mol/L HCl和100 L樟脑磺酸钠溶液（6.3.7）。
9.3 标准溶液省去匀浆和离心处理步骤，按同样方法处理。
9.4 HPLC
9.4.1 按7.22 HPLC设定条件，以自动进样器注入100 L样品溶液。
9.4.2 样品基体应在庆大霉素和新霉素出峰位置处无干扰。
9.4.3 检测器对庆大霉素和新霉素的线性关系可通过校正曲线确定。
9.4.4 庆大霉素（3个组份出一个峰）保留时间为4.0～4.1min，新霉素保留时间为5.3～5.4min。
10. 计算结果
样品中庆大霉素和新霉素浓度通过内插工作曲线法获得，工作曲线由添加样品峰面积对添加样品浓度制得。如果结果可疑，可对可疑阳性样品添加较大浓度标准溶液进行检测，如果重复检验结果在出峰位置只出一个大的峰，说明筛选检验结果确实是阳性的
10.2 （注意：阳性样品非常少，现推荐一个确证阳性样品的有效方法）
阳性样品定量应做平行样分析，工作曲线应覆盖阳性样品估值范围，工作曲线至少包括5个点（每个点重复测试3次）。工作曲线的覆盖范围应是从0至比可疑阳性样品估计浓度大10%。
10.3 优先使用确证的方法。使用该法以前必须对该法进行实验室内部重现性和重复性的确证。测定结果的不同浓度的样品添加分析应分三天内完成，回收率应在45～110%之间，批间样品和批内样品的变异系数应小于15%
牛组织中庆大霉素添加Nancy分析实验室的典型结果如下：
组织相关系数r 0.1 g/g添加 0.8 g/g添加 0.1 g/g添加 0.1 g/g添加
n =7 回收率（%）回收率（%） SD（%） SD（%）
标准溶液 0.9999 100 100 3.2 2.2
肝 0.9986 98 70 11.8 5.6
肾 0.9974 68 83 12.7 8.2
脂肪 0.9991 79 77 6.1 4.3
肌肉 0.9989 88 74 9.9 8.2
10.4 0.5 g/mL庆大霉素和新霉素标准溶液HPLC测定峰参数如下：
庆大霉素新霉素
保留时间（min） 4.0-4.1 5.3-5.4
分配因子（k＇） 2.2 3.3
理论塔板数/m 16225 9784
拖尾因子 1.2 1.4
选择性系数（） 1.5 1.5
分离度（Rs） 2.1 2.1
11-15 略
16.检验流程图
组织样品→三氯乙酸萃取→离子交换色谱→HPLC→结果计算

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