请坛子里的大牛们帮我看下有什么办法可以分离的跟好些?
最近要检测次黄嘌呤肌苷(IMP)又称肌苷酸,是核苷酸的一种。水溶液稳定,呈中性,在酸性溶液中加热易分解。由于这种物质的极性较大用C18柱分离保留时间很短大约是4.7分钟出峰,不能满足在生物样本中的检测要求,因为生物样本中比如血浆的杂质比较多难以清除。
使用的是waters717系列的HPLC C18 4.6×200mm依立特的反向柱(新柱)
流动相是采用20mM磷酸缓冲溶液:乙腈:三乙胺(98.5:1:0.5)
流速为1.1ml/min
柱温:35
用甲醇:水=2:8溶解IMP
进样量:10微L
使用乙腈是因为文献上用了它,柱温,流速也是,而为了修正峰型自己加了三乙胺。
还有就是觉得奇怪进生物样本时,目标峰有所延迟大约5.2分钟出来,但是还是不能和前面的后面的峰分开,最好是在6分多钟出峰。
谢谢大家~~!希望大家群策群力,多多建议~:)
非常感谢大家的帮忙,保留时间的问题已经解决了~~!:)
不过又出现了新的问题~-.-!
现在将条件改成:
20mM磷酸缓冲液:甲醇:三乙胺(V:V:V)=98.9:1:0.1 pH=2.5
现在的目标峰保留时间能调整到8分钟左右了,在标曲中与杂质分离地很好,但是在加入底物孵育的条件后底物峰很大,因为浓度很高了在体系中有1.95mM/L。所以一直造成拖尾严重,基线一直不能下降到0的位置,影响到了目标峰
已经试过的条件有:1 将pH调整到2.3,峰型有所改变但是还是不能分开。
2 调整三乙胺的浓度,0.5完全分不开,0.05没有太大的改善。
3 这个浓度是文献中做过酶动力学实验的,如果降低底物浓度,要求再做酶动力学验证比较复杂,是费力不讨好的事情。
希望大家再次伸出援手呀~~能早日解决这个难题,回家过年!~谢谢~!
将最近的图片上传,大家帮忙看看吧,谢谢~!
甲醇的浓度越大不是洗脱能力更强了么,应该更加分不开了吧~
梯度洗脱没有条件啊~~泪奔~