(2)过碘酸盐氧化法:本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结,其最佳比例为:酶/抗体=1-2/1。此法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所有试剂较为强烈,各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定,因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好。纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高效
液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分:游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果,但费用较贵。
结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时,能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
4 结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质,保存不当,极易失活。高浓度的结合物较为稳定,冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但冻干过程中引起活力的减低,而且使用时需经复溶,颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应,配以稀释液(见3.2.5)临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液,使用时不需再行稀释,在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低,结合物易失活,需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠),以防止细菌生长。
5 结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上,在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%牛血清白蛋白),通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,如吐温20,0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时,血清标本需稀释后进行测定,也可应用这种稀释液。
酶的底物
1 HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应,最具代表性的过氧化物为H2O2,其反应式如下:
DH2+ H2O2 D+ H2O
上式中,DH2为供氧体,H2O2为受氢体。在ELISA中,DH2一般为无色化合物,经酶作用后成为有色的产物,以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD)、四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3-ethylbenziazobine sulfonate-6)]。
OPD氧化后的产物呈橙红色,用酸终止酶反应后,在492nm处有最高吸收峰,灵敏度高,比色方便,是HRP结合物最常用的底物。OPD本身难溶于水,OPD•2HCL为水溶性。曾有报道OPD有致异变性,操作时应予注意。OPD见光易变质,与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定,须现配置现用。在试剂盒中,OPD和H2O2一般分成二组分,OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式,片剂中含有发泡助溶剂,使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中,有制成易保存的浓缩液,使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02% H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色,目视对比鲜明。TMB性质较稳定,可配成溶液试剂,只需与H2O2溶液混和即成应用液,可直接作底物使用。另外,TMB又有无致癌性等优点,因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后,TMB产物由蓝色呈黄色,可在比色计中定量,最适吸收波长为405nm。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感,但空白值极低,也为一些试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA],经HRP作用后,产物显荧光,可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高,仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。H2O2应用最多,但尿素过氧化物为固体,作为试剂较H2O2方便、稳定。试剂盒供应尿素过氧化物片剂,用蒸馏水溶解后,在底物缓冲液中密闭、低温(2~8℃)可稳定1年。
2 AP的底物
AP为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作为底物,可制成片剂,使用方便。产物为黄色的对硝基酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA作荧光测定,敏感度较高于用显色底物的比色法。
洗涤液
在板式ELISA中,常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸,其浓度按加量及比色液的最终体积而异,在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品,同时也作为判断结果的对照,因此对照品,特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定,对照品最好也为人血清,因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到,国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆(recalcified human plasma)为原料,即在血浆中加入钙离子,使其中的纤维蛋白质凝固,除去凝块后所得的液体,其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测,确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg,最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质,其中加入一定量的待检物质,此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称,在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较,可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml,阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂,以利保存。
参考标准品
定量测定的ELISA试剂盒(例如甲胎蛋白质癌胚抗原测定等)应含有制作标准曲线用的参考标准品,应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度,一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。