主题：【求助】有人用HPLC检测过estrone雌激素酮吗？

原文由 hanei 发表:
请教各位！

有没有人用HPLC检测过雌激素酮的水溶液？能检测到的最低浓度是多少？我不想用有机溶液助溶，看到文章中有人用SPE前处理，做SPE的目的是不是只是为了浓缩？另外,HPLC可以直接测出浓度吗？是不是不需要用已知浓度的溶液做标准曲线？问题有点白痴，希望大家耐心包涵！谢谢！

SPE只是去掉一些高残留性的物质，不能达到浓缩的效果。
HPLC不可以直接测到浓度，只能通过内标或外标和其他方法来算，这是需要已经浓度的物质。

多谢帮助！！

1.2样品前处理方法

1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法

提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 80% 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，加入9mL超纯水稀释，涡旋混匀后，待过Cleanert PEP柱净化。

净化步骤：

1)      活化：以5mL乙腈，5mL水活化Cleanrt PEP；

2)      上样：把上述稀释后的样品溶液过柱，流速控制以1mL/min为宜；

3)      淋洗：待样品溶液完全通过小柱后，用5mL 5%乙腈淋洗小柱，然后真空抽干3min；

4)      洗脱：以3-5mL乙腈洗脱目标，收集流出液；

5)      浓缩：收集液以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL，混匀后过0.22μm微孔滤膜过，进LC-MS/MS分析。

1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法

提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，待过Cleanert Silica柱净化。

净化步骤：

1)      活化：以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱；

2)      上样：把上述提取液过柱，收集流出液；

3)      淋洗：以5mL乙腈洗涤小柱，收集流出液；

4)      浓缩：合并以上流出液液，以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。

1.3  LC-MS/MS检测条件

1.3.1孕激素（醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）测定

液相色谱条件：色谱柱 (Halo C18， 2.1×100mm, 2.7μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B: 甲醇，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃,进样量：10μL

参考质谱条件：电离源：电喷雾正离子模式；其他（略）

1.3.2雌激素（雌二醇、雌酮）测定

液相色谱条件：色谱柱（Halo C18 2.1×100mm,2.7μm）；流动相：A：水，B: 乙腈，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃, 进样量：10μL

参考质谱条件：电离源：电喷雾负离子模式；其他（略）

2．结果与讨论：

结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果，添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。

用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离，大大提高工作效率。

雌二醇和雌酮两种激素，质谱相应偏低，质谱条件需要进一步优化。

本实验结果采用单点定量判定，结果可能有失偏颇，详细数据需做基质添加标准曲线确证，方法的精密度，稳定性等亦需要进一步确证。

图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图（标品）

图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图（奶粉样品）

多谢

原文由 博纳艾杰尔(sh100800) 发表:
1.2样品前处理方法

1.2.1 Cleanert PEP样品提取净化法

提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 80% 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，加入9mL超纯水稀释，涡旋混匀后，待过Cleanert PEP柱净化。

净化步骤：

1)      活化：以5mL乙腈，5mL水活化Cleanrt PEP；

2)      上样：把上述稀释后的样品溶液过柱，流速控制以1mL/min为宜；

3)      淋洗：待样品溶液完全通过小柱后，用5mL 5%乙腈淋洗小柱，然后真空抽干3min；

4)      洗脱：以3-5mL乙腈洗脱目标，收集流出液；

5)      浓缩：收集液以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL，混匀后过0.22μm微孔滤膜过，进LC-MS/MS分析。

1.2.2 Cleanert Silica样品提取净化法

提取：取2g奶粉，加标，然后加12mL 乙腈，涡旋混匀两分钟后，离心（90000r/min， 6min）取3mL上清液，待过Cleanert Silica柱净化。

净化步骤：

1)      活化：以5mL乙腈活化Cleanrt Silica小柱；

2)      上样：把上述提取液过柱，收集流出液；

3)      淋洗：以5mL乙腈洗涤小柱，收集流出液；

4)      浓缩：合并以上流出液液，以氮气浓度吹干（40℃水浴），后以50% 甲醇水定容至1mL混匀后过0.22μm微孔滤膜，进LC-MS/MS分析。

1.3  LC-MS/MS检测条件

1.3.1孕激素（醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮）测定

液相色谱条件：色谱柱 (Halo C18， 2.1×100mm, 2.7μm)；流动相：A：0.1%甲酸水，B: 甲醇，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃,进样量：10μL

参考质谱条件：电离源：电喷雾正离子模式；其他（略）

1.3.2雌激素（雌二醇、雌酮）测定

液相色谱条件：色谱柱（Halo C18 2.1×100mm,2.7μm）；流动相：A：水，B: 乙腈，梯度条件（略）；流速：0.3mL/min，柱温：40℃, 进样量：10μL

参考质谱条件：电离源：电喷雾负离子模式；其他（略）

2．结果与讨论：

结果见图1、图2。用Cleanert PEP (反相)或Cleanert Silica CM(正相) 两种净化手段均可到达满意的回收率和净化效果，添加浓度在25ppb时回收率可达到80% 。

用Halo色谱柱可以实现样品的快速分离，大大提高工作效率。

雌二醇和雌酮两种激素，质谱相应偏低，质谱条件需要进一步优化。

本实验结果采用单点定量判定，结果可能有失偏颇，详细数据需做基质添加标准曲线确证，方法的精密度，稳定性等亦需要进一步确证。

图1 两种孕激素总离子流图和选择离子流图（标品）

图2 两种雌激素总离子流图和选择离子流图（奶粉样品）