主题：【原创】【第二届网络原创作品大赛】分光光度计应用于口服液中的成分检测

3.3  精密度试验
用紫外分光光度计取0.04mg/mL黄芩苷对照品溶液连续测吸光度，结果见表7。
    表7  黄芩苷对照品溶液的吸光度值 见附件4
实验结果表明，该方法精密度良好。
3.4  稳定性试验
    表8  稳定性试验结果  见附件4
3.5  回收率试验结果
采用加样回收率试验，精密量取已测定含量（含量为0.0163mg）的双黄连口服液1.0mL共五份，精密加入黄芩苷对照品溶液1.0mL五份，其质量分别为0.016mg、0.02 mg、0.032mg、0.04mg、0.08mg，按含量测定项的方法制备供试液，测紫外的结果见表9。
    表9  回收率试验表  见附件4
附件4

3.6  提取工艺
3.6.1  黄芩苷预实验结果与讨论
（1）预实验黄芩用量20g时，在波长为276nm下用紫外分光光度计测得黄芩苷的吸光度值。
    表10  黄芩苷的吸光度值  见附件5
药典规定黄芩苷含量不得低于9.0%。
因为预实验结果15.2%，符合药典规定接近，说明本实验所用药材有效成分符合药典规定。
3.6.2  黄芩苷正交实验结果与讨论
3.6.2.1  正交设计筛选提取工艺
根据预试验，并参考相关文献，影响双黄连口服液制备的主要因素有：溶剂量、提取时间、提取次数。对每种因素各取3个水平，按L9(34)正交表试验设计要求进行试验。
  表11  L9(³⁴)正交表试验数据分析表 见附件5
  表12  提取率方差分析表                      见附件5

由方差分析表，得知A、C有显著影响，B无显著影响。
  表13  A因素各水平平均数多重比较            见附件5

由上表（表13）得，A2优于A3 。
  表14  C因素各水平平均数多重比较            见附件5
由上表得，C2对指标影响大。
  表15  B因素各水平平均数多重比较            见附件5
由上表得，B3对指标影响较大。
3.6.2.2  实验结果分析
（1）影响因素：极差数据RC﹥RA﹥RB。说明C因素为主要因素，A因素次之，B因素对实验的影响最小。即提取次数对黄芩苷含量影响最大，溶剂与药品比例次之，提取时间影响最小。
（2）各列水平情况：根据各因素多重比较结果看出，第1列A因素II﹥III﹥I；第3列C因素II﹥III﹥I；。第2列因素B水平可任选一水平，但考虑生产成本与效率，应选煎煮时间最短的。故最佳的提取条件为A因素取2水平（A2），C因素取3水平（C2），B因素取1水平（B1），
（3）方差分析：溶剂与药品比例对黄芩苷含量影响非常显著（P﹤0.01），提取次数对黄芩苷含量影响显著（P﹤0.05），而提取时间对黄芩苷含量影响无显著意义（P﹥0.05）。三因素中影响黄芩苷提取率的大小顺序为A＞C＞B。较好的水煎醇沉提取工艺方案为A2B1C2。即影响黄芩苷提取率的因素依次为溶剂与药品比例，提取次数，提取时间。较为合理的方案溶剂与药品比例为8倍，提取次数2次，提取时间为1h。

3.6.2.3重复性试验
  表16  重复性试验数据                      见附件5

附件5

3.7  纯化工艺
3.7.1  乙醇浓度的考察结果与讨论
    从最佳提取工艺的样品浓缩液分别取出50mL后，加入无水乙醇，使混合后溶液的含醇量达到50%、60%、75%。并通过调节pH值、过滤等步骤完成纯化工艺。数据见表17。
  表17  醇沉工艺乙醇浓度的考察  见附件6
从实验结果分析，醇沉浓度越高，澄清度越好，但含量降低。醇沉浓度为50%时，黄芩苷含量虽高，但是澄清度差、浑浊；而60%的乙醇浓度下，澄清状况良好、无浑浊、无沉淀，含量降低；醇沉浓度为75%时，虽然其澄清度最好，但含量稍低，可能由于醇的浓度高，黄芩苷有效成分被沉淀下来，所以要考虑梯度醇沉，从50%的乙醇浓度增加醇的浓度来考察含量是否受到乙醇浓度的影响，并且观察其澄清度是否更好些。
3.7.2  醇沉次数的考察结果与讨论
  表18  醇沉次数的考察          见附件6
由实验结果看出，醇沉次数越多，黄芩苷含量降低，但澄清度越好。醇浓度越高，能沉下更多的物质。二次醇沉时，虽然黄芩苷含量稍微增加，但是75%的乙醇浓度不会明显降低其含量，从试验效率与成本综合考虑，进行一次醇沉。
3.7.3  纯化工艺的讨论
综合醇沉次数和醇沉浓度的单因素考察结果看，说明提取工艺中，黄芩苷提取的很充分；由实验结果看出，醇沉次数越多，黄芩苷含量降低，二次醇沉不能明显增加黄芩苷含量，所以综合考虑进行一次醇沉为佳；醇沉浓度越高，能沉下更多的物质，澄清度越好。

附件6

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3.8  含量测定
3.8.1  紫外分光光度计的定量分析
因为黄芩苷与绿原酸在最大吸收波长处有重叠，考虑到用紫外分光光度计测定绿原酸与黄芩苷的吸光度会有干扰，而且药典实验方案是黄芩单独煎煮，金银花、连翘合煎，可能因为黄芩苷与绿原酸互相发生化学反应，所以，本试验参考药典的方法，黄芩苷与绿原酸单独煎煮，这样黄芩苷与绿原酸在最大吸收波长处互不影响。
    对黄芩苷的单独提取与纯化工艺，用紫外分光光度计测定黄芩苷的吸光度，实时控制方便、方法快速、简便，而且不会受到绿原酸的干扰。
3.8.2  高效液相色谱的定量分析
（1）因为成品中绿原酸、黄芩苷在最大波长处有重叠，用紫外分光光度计测含量受干扰，不准确，所以，用高效液相色谱仪测定成品中绿原酸、黄芩苷的含量。
药典规定：本品每支10mL含黄芩苷（C21H18O11）计，不少于80mg。本品每1mL含金银花以绿原酸（C16H18O9）计，不得少于0.60mg。
（2）黄芩苷高效液相图         
  图2  黄芩苷对照品图 见附件7
  图3  样品图        见附件7
已知，对照品中黄芩苷的浓度为0.04mg/mL，对照品与样品分别进样都为10μL，根据下列公式计算样品中黄芩苷的含量。
  _S1/(_C1*_V1)=_S2/(_C2*_V2)

S1——对照品中主成分的峰面积
S2——样品中主成分的峰面积
C1——对照品中主成分的浓度，mg/mL
C2——对照品中主成分的浓度，mg/mL
V1——取的对照品中主成分的体积，mL
V2——取的对照品中主成分的体积，mL
代入公式求得C2
  C2=0.00234mg/mL
即样品中黄芩苷的含量为：0.00234*100*20*2=9.4mg/mL
（3）引用：绿原酸高效液相图的结果：绿原酸的含量为2.5mg/mL。

附件7

3.9 矫味剂-白糖加入量的考察结果与讨论
取样品液10mL适量3份，置于三个50mL烧杯中，向其中依次加入白糖1g、2g、3g，考察结果如下表19。
    表19  白糖加入量的考察 见附件8
从上表可见，加入白糖量不同，有口感与澄清度的不同。比较以上三种加入量，以加白糖2g为佳，即白糖的浓度为0.2g/mL，味甜，微苦，而且无混浊，澄清。
白糖的加入量主要从主、客观分析。主观方面，不同人的味蕾对味觉的感受不同，加入的量干扰味蕾，而矫味；客观方面口服液中金银花、黄芩、连翘都有苦味。所以，加入白糖可矫苦味。取样品液为50mL时，加入白糖10g。
3.10 成品制备
按上面所述方法制备三批，进行质量检查。
3.11  双黄连口服液的质量检查
3.11.1  性状
本品为棕红色的澄清液体；味甜，微苦。
从这个结果可以看出，采用的提取、纯化工艺的合理。
3.11.2  鉴别
采用薄层色谱法，对处方中绿原酸、黄芩苷进行定性鉴别。
（1）黄芩苷的定性鉴别结果
取样品溶液1mL，加75%乙醇5mL，摇匀，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加入75%乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各1μL～2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，黄芩在与对照品色谱的相应位置上，显示相同颜色的荧光斑点。
（2）绿原酸的定性鉴别结果
取样品溶液1mL，加75%乙醇5mL，摇匀，作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加入75%乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（附录VI B）试验，吸取上述三种溶液各1μL～2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视。供试品色谱中，金银花在与对照品色谱的相应位置上，显示相同颜色的荧光斑点。
由于试验时间仓促，没有对展开剂进行考察，没有进行选择较好的展开剂，斑点没有很好地展开，但试验现象仍然出现相同颜色的荧光斑点。出现这个结果也可能是铺板前硅胶气泡没排净，所铺板有小凹坑，所以实验中要考虑相关的影响因素，以致排除它们，才能达到好的实验结果。
鉴别结果说明，黄芩与金银花存在于药味中，它们的主要药效成分就是黄芩苷、绿原酸。
3.11.3  检查
（1）相对密度
取三个成品，测其密度，再取平均值。结果见表20。
  表20  成品的密度  见附件8
认为该双黄连口服液的相对密度为1.13，不低于1.12（中国药典2000年版一部附录），所以，其相对密度符合标准。
（2）pH值
取三批成品，测其pH值，再取平均值。结果见表21。  见附件8
从上表结果看，认为该双黄连口服液的pH值为6.5，介于5.0～7.0，符合标准。
（3）澄清度检查
    无白点，无絮沉淀，澄清度良好。
（4）装量差异
  表22  装量差异  见附件8
结果表明，装量符合规定，装量差异不显著。

（5）有效成分含量测定
取成品5支，高效液相测定有效成分含量，结果见表23。
  表23  有效成分含量测定  见附件8
（6）加速试验结果
  表24  加速试验考察表    见附件8
从上表的结果看，药物在60℃、80℃时，10天内不稳定，在40℃以下10天内稳定。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                     

楼主写得好详细，辛苦了，
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