主题：【讨论】黄曲霉毒素大讨论。。。。。。（加分鼓励）

尿中黄曲霉毒素代谢产物的高效液相色谱测定法 
 
 
    卫生毒理学杂志 2000年第4期第14卷 方法研究
作者：孙桂菊　贺霞　钱耕荪　浦跃朴　金锡鹏　王加生
单位：孙桂菊（东南大学医学院营养与食品卫生系，南京 210009　上海医科大学公共卫生学院）；贺霞（Johns Hopkins University School of Hygiene and Public Health ）；钱耕荪（上海市肿瘤研究所）；浦跃朴（东南大学医学院营养与食品卫生系，南京 210009）；金锡鹏（上海医科大学公共卫生学院）；王加生（Texas Tech University Institute of Environmental and Human Health）
　　黄曲霉毒素(AF)是一类毒性和致癌性很强的化合物，为第一类人类致癌物［1］ ，是人类原发性肝癌的主要致病因素之一［2～4］，其中毒性和致癌性最强的为AFB1，进入机体后除形成AFM1、AFP1等外，也可被活化为AFB1-8，9-环氧化物，攻击DNA形成AFB1-N7-鸟苷(AFB-N7-GUA), 可经尿液排出，攻击蛋白质形成AFB1-白蛋白加合物而残留于血液中［5］。机体中II相代谢酶如谷胱甘肽转硫酶（GSTs）可使谷胱甘肽与AFB1-8,9-环氧化物结合，终以AFB-硫醇尿酸(AFB-NAC)的形式经尿排出［6］，许多化学物质可影响机体I相与II相代谢酶的活性，进而改变AF代谢产物的排泄类型，所以测定尿中AF不同代谢产物的排出，不仅可评价机体的暴露水平也可为研究化学预防的机制提供科学依据。过去对人体尿中AF的排出的研究主要集中在AFM1［7，8］，测定方法有薄层层析、酶联免疫及高效液相色谱法(HPLC)等［2,9］。作者在美国Johns Hopkins University公共卫生学院环境卫生系进修期间对单克隆抗体亲和层析柱结合HPLC同时检测尿中多种AF代谢产物的方法学进行了探讨。
　　1　材料与方法
　　1.1　试剂与材料　 AFM1、AFB1、AFP1为SIGMA公司产品，AFB-N7-GUA 和AFB-NAC为所在实验室合成。其他所用试剂均为美国可购得最高纯度级产品。HPLC检测系统为Hawlett packed 1 040 A型紫外分光（UV）检测器并联Dynmax FL-2型荧光检测器（激发波长366 nm，发射波长436 nm）。HPLC柱为C185 μm（4×250 mm）的Microsorb反相分析柱（Rainin，Inst. Co.生产）； LCQ高效液相-质谱仪（LC/MC，Thermoquest Co）。
　　1.2　方法　人体尿样的收集：样品为所在实验室与我国的两项合作研究所采样品，采自广西扶绥县和江苏启东县两肝癌高发区成年居民。尿样为连续两天清晨收集12 h的整夜尿，分装出150 ml（50 ml×3）冰冻，空运至美国，-80 ℃冰冻保存。
　　HPLC检测系统条件设置：HPLC检测系统流动相为5mmol三乙醇甲酸铵（TEAF）水溶液和无水乙醇，色谱分离采用梯度分离，25 min之内乙醇比例从体积分数为10%上升至25%，流速为1 ml/min，柱温50 ℃，检测限AFM1为10 pg，AFB-NAC和AFB1为50 pg，AFP1和AFB-N7-GUA为0.5 ng。配制标准系列进行HPLC分析，AFP1、AFB-N7-GUA按UV峰面积定量，AFM1、AFB-NAC和AFB1按荧光峰面积定量，用峰面积和标准浓度求得标准曲线。以样品色谱图对应标准物保留时间洗脱峰面积通过标准曲线定量。
　　测定方法：免疫亲和柱树脂的成分为2 B11、2F5和IIA4 B3 3种单抗的树脂混合物，比例为2∶2∶1，其制备过程见已发表文献［10～13］。免疫亲和柱对AF代谢产物结合能力、方法的回收率测定及尿中AF生物标记物的测定方法流程按图1所示。
　　尿中所测AF代谢产物的确正：收集HPLC各标准物保留时间段的洗脱液，经过浓缩柱、甲醇洗脱，高纯氩气浓缩至50 μl后，用LC/MS对AF代谢产物进行结构分析确证［6］,LC流动相为5 μmolTEAF、体积分数为100%的甲醇和体积分数为100%的乙腈，分离梯度为开始的4%乙腈/2%甲醇，25 min内上升为13%乙腈/12%甲醇。质谱仪检测范围为200～600 m/z，碰撞能为25%和30%。
　　2　结果
　　2.1　尿中黄曲霉毒素生物标记物的HPLC分离及紫外和荧光图谱　所测5种生物标记物混合标准经HPLC分离后的紫外和荧光光谱见图2，AFP1和AFB-N7-GUA的荧光较弱，而AFM1、AFB1、AFB1-NAC则适于荧光分析。
　　结合能力=过免疫亲合柱标准物的峰面积/未过柱峰面积*100%；表中数据为4～6次试验的±s；a:混合标准100 ng指5种标准物的量分别为20 ng，混合标准200 ng?指5种标准物的量分别为40　ng
　　2.2　免疫亲和层析柱对AF代谢产物结合能力　如表1所示免疫亲和层析柱对单一标准物的结合能力较强，容量为1 ml的免疫亲合柱可结合高达100～200 ng的单一AF标准，该剂量超过尿样中AF含量的100～1 000倍，进一步证明采用1 ml的免疫亲合柱测定尿中AF生物标记物是适宜的。用混合标准物时亲合柱对尿中AF结合能力依次为AFM1≈AFB1≈AFP1＞AFB1-NAC＞AFB1-N7-GUA, 说明不同的AF代谢产物之间存在竞争性结合。
　　2.3　方法回收率　方法回收率试验表明随着加标量的不同其回收率有一定的变化，尿中主要的代谢物AFM1的研究表明，500 pg以下可达到全部回收，剂量增至5～10 ng回收率尽管有所下降，但仍可达80%左右（表2），说明该方法的回收率是可以接受的。其他AF代谢物的回收率见表2。
　　2.4　人群尿样中AF代谢产物的测定　用本方法对采自广西扶绥和江苏启东的76份尿样进行了AF生物标记物的测定，如表3所示，扶绥居民尿中的AF代谢产物含量显著高于启东居民（P＜0.01）， 88.9%（24/27）的扶绥居民尿样中可检出AFM1和AFB-NAC，AFB-N7-GUA和AFP1的检出率较低，分别为37.0%（10/27, 0.390±0.141 ng/mg肌酐）和29.6%(7/27, 0.194±0.044 ng/mg肌酐)，而AFB1则未检出。启东居民尿样中AFP1、AFB-N7-GUA和AFB1未检出。
　　2.5　尿中AFM1和AFB1-NAC的确证　收集尿样HPLC分析AFM1和AFB1-NAC保留时间段的洗脱液， LC/MS图谱（未列出）可以看到质/荷比（m/z）=329.2的AFM1分子标准特征离子，碰撞反应后可以见到m/z=329.2离子失去一个CO+基团后的m/z=301.2离子，及再失去一个CO+基团的m/z=273.3离子； 另外也有m/z=492的AFB-NAC分子标准特征离子，离子碰撞反应后可见失去N-乙酰半胱氨酸后的离子m/z=329.1。
　　a:表中数据为6次试验的+s，b:尿样先经OASIS去除杂质后进行测定的结果

3　讨论
　　以往AF的测定方法主要有薄层层析色谱法和经物理化学方法提取后进行HPLC测定，随着免疫技术的发展建立了酶联免疫法（ELISA）、放射免疫测定（RIA）［12，13］。本研究将层析色谱法和免疫学方法结合起来，应用免疫亲合层析结合HPLC荧光检测系统进行了尿中AF代谢产物测定的研究，通过免疫亲合柱可将尿中AF代谢产物进行特异性的浓缩，再通过HPLC将不同种类的生物标记物进行分离，提高了测定的灵敏度和特异性。本方法最早由Groopman实验室建立并作为人体AF生物标记物应用于人群流行病学的调查中［2,6,14～15］，但其测定多为应用单一抗体和HPLC后的紫外分光光谱法，我们将2B11、2F5和2A4B3 3种抗体树脂混合使用，其中IIA4B3抗体为新发展的对AFB-赖氨酸和AFB-N7-GUA加成物亲合力较强的单克隆抗体(未发表资料)，所用HPLC系统同时联接荧光分光光度计，使灵敏度提高达100倍并可同时测定多种代谢产物。该免疫亲合层析柱对不同的AF代谢产物的亲合力不同，且相互间存在一定的竞争，以AFM1、AFP1和AFB1的亲合力较高，另外发现尿中的杂质可影响检测的回收率，如用10　ml尿样直接过免疫亲合柱时发现AFB-N7-GUA的回收率较低，而经OASIS柱去除杂质后则回收率明显提高。
　　广西扶绥和江苏启东两肝癌高发区人群的尿样检测结果表明，启东居民尿中AFM1的检出率为100%，但含量显著低于广西扶绥县居民尿中的含量，后者 AFB-NAC的排出量也显著高于江苏启东县的居民（P＜0.01），过去这两个地区居民均以玉米为主食，据我们曾做的调查资料表明启东居民已改大米为主食，而广西扶绥居民膳食中玉米仍占较大比例（资料将在他处发表），这可能是启东居民尿中AF代谢产物排出较低的原因之一，有必要做进一步的对比研究。尿中AFB-NAC的检出是国内首次报道，Wang等［6］报道在服用吡噻硫酮的人群尿样中AFB-NAC的含量增高，本次结果表明在不服用化学预防剂的人群尿样中也可检出AFB-NAC，说明体内AF解毒与代谢活化同时存在。
　　对尿中AF代谢产物的确证过去仅靠化学衍生法与HPLC结合紫外分光光度法［11，15］，现应用液质联谱仪直接对HPLC分析中所收集的标准峰时段的洗脱液，浓缩处理后进行结构分析，具很高的可信性。对检出率较高的AFM1和AFB-NAC取得了满意的结果，证明了本方法的准确性。
　　参考文献
　　［1］　IARC-WHO. Some naturally occurring substances: Food items and constituents, heterocyclic aromatic amines, and mycotoxins. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Vol. 56, Lyon France, 1993.245-362.
　　［2］　Ross RK, Yuan JM, Yu MC， et al. Urinary aflatoxin biomarkers and risk of hepatocellular carcinoma. Lancet 1992,339:943-946.
　　［3］　Qian GS, Yu MC, Ross R， et al. A follow-up study of urinary markers of aflatoxin exposure and liver cancer risk in Shanghai. PRC. Cancer Epi Biomarkers Preven， 1994,3:3-10.
　　［4］　Kuang SY, Fang X, Lu BX, et al. Aflatoxin-albimin adducts and risk for hepatocellularr carcinoma in residents of Qidong, People's Republic of China. Proc Am Assoc Cancer Res,1996,37:252.
　　［5］　Eaton DL, Ramsdell HS， Neal Gordon E. Biotransformation of aflatoxins. In Eaton D L and Groopman J D ed The Toxicology of Aflatoxins. Academic Press, 1994. 45-65.
　　［6］　Wang JS, Shen XN, He X， et al. Protective alterations in phase 1 and 2 metabolism of aflatoxin B1 byoltipraz in residents of Qidong, People's Republic of China. J Natl Cancer Inst, 1999,911:347-354.
　　［7］　陆培新，乙型肝炎表面抗原携带者尿中黄曲霉毒素M1排出量测定.肿瘤,1993, 5: 267-259.
　　［8］　涂文升，广西肝癌高低发区儿童摄入黄曲霉毒素B1与尿中排出黄曲霉毒素M1的关系研究.中华预防医学杂志,1993,4: 218-220.
　　［9］　刘银坤.黄曲霉毒素的酶联免疫测定法及其在肝癌流行病学研究中的应用评价.上海医科大学学报,1990, 6: 421-426.
　　［10］　Groopman JD, Zhu JQ, Donahue PR， et al. Molecular dosimetry of urinary aflatoxin-DNA adducts in people living in Guangxi Autonomous Region, People's Republic of China. Cancer Res 1992,52:45-52.
　　［11］　Groopman JD, Hasler JA, Trudel LJ， et al. Molecular dosimetry in rat urine of aflatoxin-N7-guanine and other aflatoxin metabolites by multiple monoclonal antibody affinity chromatography and immunoaffinity/high performance liquid chromatography. Cancer Res， 1992，52:267-274.
　　［12］　Groopman JD, Trudel LJ, Donahue PR, et al. High-affinity monoclonal antibodies for aflatoxins and their application to solid-phase immunoassays. Proc Natl Acad Sci， 1984,81:7728-7731.
　　［13］　Groopman JD, Haugen A, Goodrich GR，et al. Quantitation of aflatoxin B1-modified DNA using monoclonal antibodies. Cancer Res, 1982,42:3120-3124.
　［14］　Groopman JD, Hall AJ, Whittle H,et al, Molecular dosimetry of aflatoxin-N7-guanine in human urine obtained in the Gambia, west Africa. Cancer Res, 1992,1:221-227
　　［15］　Cheng Z, Root M, Pan W,et al, Use of an improved method for analysis of urinary aflatoxin M1 in a survey of mainland China and Taiwan. Cancer Epi. Biomarkers & Prevention, 1997,6:523-529
　　(志谢：本文研究内容为笔者在Johns Hopkins University School of Hygiene and Public Health 环境卫生系John D. Groopman 实验室进修时完成，在此感谢该实验室的所有成员。)

很强的致癌性！腐烂变质的东西不能吃

原文由 Pfz1985 发表:
很强的致癌性！腐烂变质的东西不能吃

能否谈你所知道的致癌机理

学习一下！！！！！

甘蔗，玉米等霉变容易产生各种类型的黄曲霉毒素，B1常见。
高温稳定，煮沸不容易去除。
1类致癌物，剧毒性，主要损害肝脏。中毒时病征有：呕吐、腹痛、肺水肿、痉挛、昏迷、或肝、肾、心衰竭或脑水肿，最终导致死亡。
检测方法，定性和半定量有现成的试剂盒可用，很方便；定量要靠LC。

黄曲霉毒素中毒(Aflatoxicosis)是人畜共患疾病之一。此病以肝脏受损，全身性出血，腹水，消化机能障碍和神经症状等为特征。世界各国对黄曲霉毒素的产生、分布和毒害等方面，进行了全面、系统、深入的研究，发表了研究论文、综述和专著等文献资料，已超过3 000篇。我国的江苏、广西、贵州、湖北、黑龙江、天津、北京等许多省市区也都有畜禽发生此病的报道。
    （一）病因
    本病的病原为黄曲霉毒素，虽然文献上的资料表明，可产生黄曲霉毒素的菌种，包括黄曲霉、寄生曲霉、溜曲霉、黑曲霉等有20多个菌种。但近来很多研究者的研究工作证实，只有黄曲霉和寄生曲霉产生黄曲霉毒素。而且，并不是所有黄曲霉的菌株都产生黄曲霉毒素。早期资料记载，从自然界分离出的黄曲霉中，只有10％的菌株产黄曲霉毒素。但是，近年来的研究工作表明，产毒素菌株所占的比例，有明显的上升趋势。
    目前已经确定出结构的黄曲霉毒素有B1、B2、B2α、B3、D1、G1、G2、G2α、M1、M2、 Pl、Q1、R0等18种，并且已经用化学方法合成出来。其中B1、B2、G1和G2是4种最基本的黄曲霉毒素，其他种类都是由这4种衍生而来。它们的化学结构十分相似，都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(又称香豆素)。结晶的黄曲霉毒素B1非常稳定，高温(200℃)、紫外线照射，都不能使之破坏。加热到268～269℃，才开始分解。5％的次氯酸钠，可以使黄曲霉毒素完全破坏。在Cl2、NH3、H202和S02中，黄曲霉毒素B1也被破坏。
    黄曲霉毒素的分布范围很广，凡是污染了能产生黄曲霉毒素的真菌的粮食、饲草饲料等，都有可能存在黄曲霉毒素。甚至在没有发现真菌、真菌菌丝体和孢子的食品和农副产品上，也找到了黄曲霉毒素。畜禽中毒就是由于大量采食了这些含有多量黄曲霉毒素的饲草饲料和农副产品而发病的。由于性别、年龄及营养状态等情况，其敏感性是有差异的。其敏感顺序是：鸭雏>火鸡雏>鸡雏>日本鹌鹑；仔猪>犊牛>肥育猪>成年牛>绵羊……，家禽是最为敏感的，尤其是幼禽。
    根据国内外普查，以花生、玉米、黄豆、棉子等作物，以及它们的副产品，最易感染黄曲霉，含黄曲霉毒素量较多。世界各国和联合国有关组织都制定了食品、饲料中黄曲霉毒素最高允许量标准。
    （二）毒理
    大量的实验资料证明，黄曲霉毒素不仅对动植物、微生物和人都有很强的毒性，而且对家禽、多种动物和人还具有明显的致癌能力。黄曲霉毒素B1是目前发现的最强的化学致癌物质，B1还能引起突变和导致畸形。
    大量的实验结果表明，黄曲霉毒素能抑制标记的前体物质参入脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)和蛋白质合成。特别是抑制标记的前体物质参入诱导的酶蛋白。黄曲霉毒素的致癌作用及其他毒害作用的分子机制就在此。
    学者们进一步的研究证实，黄曲霉毒素对核酸合成的抑制，可能是由黄曲霉毒素直接作用于核酸合成酶引起的，或是由于黄曲霉毒素和DNA的结合，改变了DNA模板引起的。
    电子显微镜的研究结果证实，在给予黄曲霉毒素后30min所观察到的最初的细胞变化，发生在核仁内，包括其内含物的重新分配。继之而来的细胞质的变化，有核糖核蛋白体的减少和解聚，内质网的增生，糖原的损失和线粒体的退化。
    黄曲霉毒素B1在动物体内的主要代谢途径有两个：一是羟基化作用，生成单羟基的衍生物M1，通常存在于奶、尿、粪便和肝脏中；二是去甲基作用，生成酚环的衍生物 P1，主要存在于尿中。此外，有一部分发生环氧化作用，生成2，3-环氧化物，再进一步与谷胱甘肽结合，生成谷胱甘肽结合物。



临床症状
    家禽中以鸭雏和火鸡对黄曲霉毒素最为敏感，中毒多取急性经过。多数病雏鸭食欲丧失，步态不稳，共济失调，颈肌痉挛，以呈现角弓反张症状而死亡。火鸡多为2～4周龄的发病死亡，8周龄以上的火鸡对黄曲霉毒素有一定的抗性。小火鸡发病后，表现嗜睡、食欲减退、体重减轻、羽翼下垂，脱毛、腹泻、颈肌痉挛和角弓反张。病雏鸡的症状基本上与鸭雏和小火鸡的相似，但鸡冠淡染或苍白，腹泻的稀粪便多混有血液。成年鸡多呈慢性中毒症状，主要呈现恶病质，降低对沙门氏杆菌等致病性微生物的抵抗力，使母鸡引起脂肪肝综合征，产蛋率和孵化率有所降低。
    血液检验，病禽血清蛋白质组分都较正常值为低，表现出重度的低蛋白血症；红细胞数量明显减少，白细胞总数增多，凝血时间延长。急性病例的谷一草转氨酶、瓜氨酸转移酶和凝血酶原活性升高；亚急性和慢性型的病例，异柠檬酸脱氢酶和碱性磷酸酶活性也明显升高



病理变化
    病死家禽在肝脏有特征性损害。急性型的肝脏肿大，弥漫性出血和坏死。亚急性和慢性型的发生肝细胞增生、纤维化和硬变，肝体积缩小。病程在1年以上者，可发现肝细胞瘤、肝细胞癌或胆管癌。


诊断鉴别
    首先要调查病史，检查饲料品质与霉变情况，吃食可疑饲料与家禽发病率呈正相关，不吃此批可疑饲料的家禽不发病，发病的家禽也无传染性表现。然后，结合临诊症状、血液化验和病理变化等材料，进行综合性分析，排除传染病与营养代谢病的可能性，并且符合真菌毒素中毒病的基本特点，即可作出初步诊断。若要达到确切诊断，必须进行以下程序检验。
    1．可疑饲料的病原真菌分离、培养与鉴定。用高渗察氏培养基于24～30℃温度下培养，观察菌落生长速度、菌落的颜色、表面和渗出物、菌落的质地和气味，记录下来后，用显微镜观察培养物的活培养检查，以及制止检查，以鉴定出此优势菌为黄曲霉菌或寄生曲霉。
    2．可疑饲料的黄曲霉毒素测定。
    (1)可疑饲料直观法：可作为黄曲霉毒素预测法。取有代表性的可疑饲料样品(如玉米、花生等)2～3kg，分批盛于盘内，分摊成薄层，直接放在365nm波长的紫外线灯下观察荧光；如果样品存在黄曲霉毒素G1、G2，可见到含G族毒素的饲料颗粒发出亮黄绿色荧光；如若是含黄曲霉B族毒素，则可见到蓝紫色荧光。若看不到荧光，可将颗粒捣碎后再观察。
    (2)化学分析法：先把可疑饲料中黄曲霉毒素提取和净化，然后用薄层层析法与已知标准黄曲霉毒素相对照，以确证所测的黄曲霉毒素性质和数量(可参照中华人民共和国食品卫生法等有关资料)。
    3．生物学鉴定法
    (1)雏鸭法：这是世界法定通用的方法。选用1日龄的雏鸭，将待测样品溶解于丙二醇或水中，通过胃管喂给雏鸭，喂4～5天。对照的各雏鸭喂给黄曲霉毒素B1的总量从0至16µg。在最后一次喂给毒素后，将鸭雏再饲养2天。然后，处死全部鸭雏，根据其胆管上皮细胞异常增生的程度(一般分为0到4或5+几个等级)，来判断黄曲霉毒素含量的多少。雏鸭黄曲霉毒素B1的LD50为12.0～28.2µg/只。另外，还可取雏鸭肝组织固定，作组织学检查。
    (2)可疑病料作动物发病试验，也可用提取的毒素作发病试验，皆可复制出与自然病



防治措施
    目前尚无治疗本病的特效药物。主要在于预防，预防中毒的根本措施是不喂发霉饲料，对饲料定期作黄曲霉毒素测定，淘汰超标饲料。现时生产实践中不能完全达到这种要求，搞好预防的关键是防霉与去毒工作，防霉和去毒两个环节应以防霉为主。
    防霉的根本措施是破坏霉败的条件，主要是水分和温度。粮食作物收割后，防遭雨淋，要及时运到场上散开通风、晾晒，使之尽快干燥，水分含量达到谷粒为13％，玉米为12.5％，花生仁为8％以下。为防止粮食和精饲料在贮存过程中霉变，可试用化学熏蒸法，如选用氯化苦、溴甲烷、二氯乙烷、环氧乙烷等熏蒸剂；也可选用制霉菌素、马匹菌素等防霉抗生素。
    已被黄曲霉毒素污染的玉米、花生饼等谷物饲料，国内外曾采用过以下几种去除黄曲霉毒素方法：(1)挑选霉粒或霉团去毒法；(2)碾轧加水搓洗或冲洗法，碾去含毒素较集中的谷皮和胚部，碾后加3～4倍清水漂洗，使较轻的霉坏部分谷皮和胚部上浮起随水倾出；(3)用石灰水浸泡或碱煮、漂白粉、氯气和过氧乙酸处理等方法解毒；(4)生物学解毒法，利用微生物(如无根根霉、米根霉、橙色黄杆菌等)的生物转化作用，可使黄曲霉毒素解毒，转变成毒性低的物质；(5)辐射处理法；(6)白陶土吸附法；(7)氨气处理法，在18kg氨压，72～82℃时，谷物和饲料中黄曲霉毒素98％～100％被除去，并且使日粮中含氮量增高，也不破坏赖氨酸。畜禽饲喂此日粮安全又增加营养，其动物组织中也未测出残留有害物质。

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ALX-630-093    Aflatoxin B1
ALX-630-095    Aflatoxin M1
ALX-630-103    Aflatoxin B2
ALX-630-104    Aflatoxin G1
ALX-630-106    Aflatoxin G2
CVL-MAB0033-01    Monoclonal Antibody to Aflatoxin 1 (5B3), Mouse IgG1


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黄曲霉B1的毒性比氰化钾毒十多倍

最表层的了解就它的强致癌性，花生玉米等易发生霉变