主题：【资料】化学分析样品制备(86讲 待续)

化学分析样品制备（71）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（45）
2．41  SPE 中的吸着剂（续）

键合硅胶（续）
      键合相可以是有机配基R的单分子层，也可以是有机配基R的多分子层，这要取决于所使用反应物是单功能(R3SiX)基还是多功能(R3SiX3)基（图 2-25）。


图 2-25  在硅胶表面上的单功能团硅烷与硅醇基反应（a） 或多功能团硅烷与硅醇基反应（b）

      有机硅烷含有可反应的基团，X，它会和在硅胶表面上的硅醇基进行反应，典型情况下反应物是有机氯硅烷，或有机烷氧基硅烷，其中X 是氯基、甲氧基、或乙氧基，因为在使用三功能团反应物做改性剂时，要遵守化学计量学规律，可以键合的功能团会有一个或两个Si-X保持未反应过，在反应过程中Si-X基团进行水解，重新产生硅醇基（图 2-26），因此削弱了吸着剂表面疏水性基团的作用，这一反应导致形成交联的网络结构，或者形成多层吸着剂。单功能团有机硅烷如烷基二甲基一氯硅烷可一获得单分子层类型的吸着剂，因为它没有可能产生未反应的硅醇基。


图 2-26 使用三功能团改性剂做反应物时行成附加的硅醇基

      与“刷子”形的单分子层固定相比较，多分子层表面结构的固定相会降低被分析物在聚合物层的传递速度，导致柱效的降低，而“刷子”形的单分子层固定相色谱柱的柱效要高。但是Thurman 和 Mills 的研究指出三功能团试剂所形成的固定相对酸很稳定，因为有机硅烷牢牢地被多重连接在硅胶表面上。

（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（72）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（46）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

键合硅胶（续）

    由于反应条件或空间阻碍，在硅胶表面上会留有未反应的硅醇基，或者在随后形成的聚合相反应中也会形成未反应的硅醇基，这些硅醇基会对目标化合物的吸着产生影响，Hennion[92]指出在pH 2时这种硅醇基没有变化，在大于pH 2时它就会加速地进行离解。在实验过程中观察到种种影响，在pH大于pH 4时硅醇基有明显的离解。当吸着剂表面有未掩蔽的硅醇基时将会对被分析物有正的、负的、或没有影响[93]，正电荷会与碱（如三乙胺、或硫氢酸四丁基铵）产生竞争作用，因而样品对残余硅醇基起了掩蔽作用。为了降低能和被分析物作用的残留在吸着剂表面上硅醇基，就开发了一种叫做“封端”的技术，为此使用一种小分子硅烷如三甲基氯硅烷和键合硅胶反应，得到疏水性更强的表面（图2-27）


图 2-27  使用三甲基氯硅烷和残留的硅醇基反应

      当使用键合硅胶SPE吸着剂（或者HPLC色谱柱）时，单分子层或多分子层固定相可能是对即定分析物-基体的最佳选择，同样情况，封端或未封端产品可能是最好的选择。上述讨论有助于分析人员在了解各个厂家生产的键合硅胶的性能，Hennion [92]最近发表了一些通用型商品键合硅胶性能的列表，包括平均孔径，用于键合硅烷的功能特性（即是单功能团，还是三功能团），是否封端，碳的百分含量等。商品键合硅胶具有各种配基 R，普通生产的键合固定相，反相应用的基团有疏水的烷基基团，如十八烷基（C18），辛基（C8），乙基（C2）或环己基，键合到硅胶骨架上。芳香族的苯基也可以键合到硅胶骨架上，R配基也可以含有氰丙基，或二醇基等亲水性功能团，形成极性吸着剂，用于正相萃取的应用中。离子型功能团包括羧酸基、磺酸基、氨丙基、或季胺基也可以键合到硅胶吸着剂上，形成离子交换吸着剂。
键合硅胶吸着剂的主要缺点是受到溶液pH值的影响而不稳顶的限制，以及在其表面上存在残余硅醇基影响其保留性能。尽管如此，键合硅胶在近二十多年一直是SPE中使用最多的吸着剂。
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（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

            化学分析样品制备（73）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（47）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

石墨化碳吸着剂
 
      石墨化碳吸着剂成功地用于从水中吸着极性强的水溶性化合物，石墨化碳吸着剂的保留行为不同于非极性的聚合物树脂和键合硅胶吸着剂。有两种类型的石墨化碳吸着剂，一种是石墨化碳黑(GCBs)，另外一种是多孔性碳(PGCs)用于SPE，GCBs 没有微孔，具有近于均质的石摸碳原子排列的表面，GCBs的吸着点是有表面上氧的络合物引起，它的数量有限，但是它与极性化合物有很强的作用力。所以石墨化碳吸着剂具有双重作用力，即通过范德华力用作非极性吸着剂，也可以通过静电作用了用作阴离子吸着剂，GCBs具有同时萃取中性、碱性和酸性化合物的潜在能力。在有些情况下无须调节样品的酸度，从石墨化碳吸着剂上脱附很困难，因为它有很强的保留能力。PGC吸着剂比GCBs具有更为高度均一的疏水性表面。
      PGCs 是大孔性材料，由平面二维碳原子排列的平行层石墨结构组成，PGC是平面均一碳原子层状的平行结构表面，具有离域p电子，使其具有独特的分离平面和非平面被分析物的特点，例如多氯联苯。
    使用GCBs固体吸着剂吸附水中痕量有机污染物 ,最显著的优点之一就是能处理大剂量的水 但是,“穿透 ”（能吸着被分析物的饱和后流出吸着柱）问题也应注意。下图是α-666的GCBs 的穿透 曲线 ,C表示流出液中某污染物的含量 ,C。为样品液中同一污染物的含量。从图 获得的单位保留体积和穿透体积列于表中。



图76-1  α-666 在100mg GCBs固体吸着剂上的漏出曲线
              （鲁连胜 张晓敏 于桂零，环境科学丛刊，1984，5（4）：19-23）

不同试验中在GCBs固体吸着剂上α-666的单位保 留体积和穿透体积见下表



              表 76-1  在GCBs固体吸着剂上α-666的单位保 留体积和穿透体积
              （鲁连胜 张晓敏 于桂零，环境科学丛刊，1984，5（4）：19-23）


（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（74）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（48）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

带功能基的聚合物树脂（1）

    在非极性聚合物树脂上键合极性功能基使其改性，制造出适合于极性化合物回收的SPE吸着剂，亲水性团如乙酰基、苯(甲)酰基、邻羧基苯(甲)酰基、2-羰基-3/4-硝基苯(甲)酰基、2,4-二羧基苯(甲)酰基、羟甲基、磺酸基、三甲基铵基、和四(p-羧苯基) 卟啉等引入PS-DVB共聚物的骨架上[1]。


苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）经过各种化学反应可以得到具有不同极性基团的SPE，如下图。


文献
[1]. M. D. Leon-Gonzalez and L. V. Perez-Arribas, J. Chromatogr. A, 902,3(2000).

（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（75）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（49）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

带功能基的聚合物树脂（2）

    往苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）引入各种极性基团，大大增加了对极性化合物的保留能力，例如Sun 和 Fritz[1]首次将醇基和乙酰基引入PS-DVB中，使其具有很好的亲水性，就不需要事先对SPE柱的冲洗湿润，并且比没有该性的吸着剂具有较高的回收率。他们把乙酰基和羟甲基引入多孔PS-DVB Amberchrome 161 (Supelco公司)上（球型，50 μm, 720 m /g)，这种树脂用做SPE，对水样有很好的湿润性，对各类有机化合物有很好的萃取性能，见下表：用Amberchrome 161–COCH萃取脂肪族化合物和吡啶类化合物的平均回收率为95%；而使用Amberchrome 161进行萃取的回收率为81%；使用键合硅胶C18进性萃取则为65%。这一比较是对18个化合物用上述不同SPE进行处理，用乙酸乙酯进行洗脱，以GC-FID进行检测得到的结果[1]。

表78  使用改性PS-DVD SPE萃取酚、芳烃、多羟基芳香族化合物的回收率比较


为了在样品制备过程中能处理大量样品可以使用乙酰化的PS-DVD膜片，他具有很好的亲水性不需要在处理前进行冲洗预处理，它的回收率也高于未乙酰化的PS-DVD膜片。有人比较了乙酰化PS-DVD吸着剂透过曲线，见下图。



图78.  苯酚在各种SPE上进行萃取的透过曲线[2]， PLRP-s (a), EnviChrom P (b), Amberchrom  (c),  乙酰化PS-DVD SPE  (d) 和 LiChrolut EN (e).

文献
[1] J.J. Sun, J.S. Fritz, J. Chromatogr. 1992,590:197.
[2] N.  Masqu et al., J. Chromatogr.1997,771:55

（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（76）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（50）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

带功能基的聚合物树脂（3）

      新一代多孔聚合物Oasis HLB SPE包括两种单体，即二乙烯基苯（亲油性）和N-乙烯吡咯烷酮（亲水性）组成，是一种把亲油性和亲水性相结合达到平衡的一种SPE吸着剂[1]。


这种由PS-DVB改性的聚合物做萃取吸着剂具有很强的适应性，既可亲水又可亲油，而且不像其他类型的SPE小柱在萃取过程中不怕抽干，不会由于抽干而造成保留性能的降低，这一特点其他类型的SPE是没有的，它适应溶液酸度的范围也远大于键合硅胶的SPE，可以从水中分离极性非极性化合物，它的容量是反相硅胶型SPE的5倍，而且这种大孔可湿润的吸着剂的保留机理比硅胶型SPE要简单。可以简单地用这种SPE萃取酸性、中性和碱性化合物，并且具有很高的回收率。用Oasis HLB SPE萃取酸性、中性和碱性化合物的流程很简单如下面的程序：


用Oasis HLB SPE萃取酸性、中性和碱性化合物的流程[1]

[1]N. Masque et al.,TrAC,1998,17(6):384

（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（77）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（51）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

离子交换吸着剂

离子交换性SPE小柱（1）

    用于离子交换的SPE吸着剂的基体是非极性的聚合物，或者是键合硅胶吸着剂。离子交换吸着剂上有可进行离子交换的功能团，如季胺盐或或磺酸基，或者是具有离子交换功能的基团，如伯/仲胺或羧酸。吸着剂上的带电荷的基团会和被分离的反向电荷的离子通过静电引力相互作用，如图2-28


图2-28被分析物和离子交换剂的反应式：(a) 强阳离子交换吸着剂，
(b) 强阴离子交换吸着剂

    在吸着剂上的功能团可以是正电荷或负电荷，当吸着剂具有正电荷时可以交换液体样品中被分析物上的反的负电荷，积累起来的过程就叫做离子交换。
前面讲述过的酸碱平衡理论可以用于吸着剂、被分析物、和离子交换过程中的样品，样品基体的pH必须调节到吸着剂的pKa值(表 2.5)

      表2.5 离子交换吸着剂的pK值


（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（78）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（52）
2．41  SPE 中的吸着剂（续）

离子交换性SPE小柱（2）

    使用离子交换性SPE小柱时，样品基体的pH必须调节与吸着剂和被分析物的pKa（表2.5）相适应，含有弱碱性基团的的阴离子SPE，如伯胺或仲胺，它们只在低pH的条件下才能电离，而强碱性季铵基团在所有pH范围的条件下都可以电离。含有弱酸基团的离子交换SPE，如羧酸只在高pH条件下才可以电离，而强酸性芳香族或脂肪族磺酸基在所有pH范围的条件下都可以电离。弱碱或弱酸离子交换吸着剂依赖于溶液的pH，因为它不能完全电离。而强碱或强酸离子交换吸着剂与溶液的pH无关，因为它可以完全电离。
    在SPE中，离子交换吸着剂和被分析物之间的相互作用，要比非极性聚合物树脂或脂肪/芳香基键合硅胶的疏水性相互作用要强烈。在离子交换剂中，分配系数，KD（公式2.2）随交换离子的电荷及大小的增加而增加[73]，离子交换过程的动力学要比非极性或极性相互作用机理要慢一些，Simpson [1]讨论了离子交换萃取的动力学影响。
当吸着剂上的反离子类似于被分析物离子的性质会增加其保留值，但是被分析物的保留值受样品基体离子强度的影响，因为存在的其他离子将会和被分析离子产生竞争性作用。

    Agilent SampliQ-SCX树脂就是对二乙烯基苯进行磺酸改性的聚合物（下图）。使这一聚合物在很宽的pKa和疏水性（logP）范围内既对碱性化合物又对中性化合物具有保留作用。


这一萃取小柱既具有阳离子交换剂保留行为，又有反相固定相的保留行为，易于进行方法的开发，这一树脂对各种溶剂有惰性，在pH 0到 14之间是稳定的。Agilent SampliQ-SAX是阴离子交换型固相萃取小柱也是这样。


                         
使用Agilent SampliQ-SCX小柱的程序很简单，有典型的五个步骤：

*  老化（冲洗）小柱
*  加样
*  水性溶剂洗涤
*  对中性化合物组分用有机溶剂洗涤
*  洗脱

（文献：安捷伦科技公司，2008，5989-8945EN技术报告）

[1]. N. J. K. Simpson, Ion exchange extraction, in N. J. K. Simpson, ed., Solid-
Phase Extraction: Principles, Techniques, and Applications, Marcel Dekker,
New York, 2000, pp. 493–497.

          化学分析样品制备（79）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（53）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

限近介质SPE小柱（1）

1  控制孔径吸着剂（Controlled-access sorbents）

      控制孔径吸着剂是指“包含”或者“排除”大的分子或高分子物质。设计宽孔或大孔吸着剂故意让大的分子能够进入吸着剂结构内孔，使之被保留。一般吸着剂的孔只有6μm，而宽孔吸着剂的孔有27.5 到 30μm。
与此相反，限进性吸着剂（restricted access media）(RAM)只保留小的分子，而排除大的分子，例如生物样品中存在的蛋白质，（图 2-29），小的分子在吸着剂的孔结构中被吸着，而大分子则通过吸着剂中的流通孔道被排出，这样的分离导致由于吸着剂的尺寸选择性把大分子基体排除于吸着剂以外。RAM不同于一般的立体体积排除吸着剂，RAM吸着剂具有双功能或双区域的特点，其中内表面和外表面是不同的，外表面的设计是为了排除大的分`子，而且是化学亲水性的，阻止生物分子的保留。小的分子可以穿透内表面，并切可以保留在上面。



图 2.29. 用于限进性色谱的限进性吸着剂


（资料来源：“Sample Preparation Techniques in Analytical Chemistry“，Editor J. D. WINEFORDNER，2003）

化学分析样品制备（80）

第二章 萃取原理和从液体中萃取半挥发性有机物（54）

2．41  SPE 中的吸着剂（续）

限近介质SPE小柱（2）

（下面五讲介绍的内容是蔡亚岐先生和牟世芬教授写的一篇有关限进介质固相萃取剂的综述，内容丰富，我和大家共同学习，并一起感谢他们）

二、  限进介质固相萃取剂的种类

（2-1） 内表面反相填料 ( internal surface reversed-phase, ISRP)
内表面反相填料是最早出现的限进介质固相萃取剂 ,它是 Hagestam等在 1985年为了使用直接注射法测定血清和血浆中的小分子药物而专门设计制造的。构成该类限进介质固相萃取剂的基质材料，是粒径 5μm孔径 8 nm的硅胶 ,在硅胶的外表面修饰有亲水性基团 ,因而具有好的亲水性和生物相容性 ,其内表面在大多数情况下修饰有疏水性基团或离子交换基团 ,具有对小分子分析物的疏水性吸附或离子交换作用。当用该萃取剂直接萃取生物或环境样品时 ,小分子分析物可进入硅胶微孔中而被微孔中的疏水性基团或离子交换基团所保留萃取;而样品基体中的蛋白质、核酸和腐植酸大分子物质等则不能进入硅胶微孔中去 ,也不会在具有亲水性外表面的硅胶上发生变性吸附 ,而在死体积或近于死体积的情况下被洗脱除去 ,从而与小分子分析物分离。这种结构上的特点决定了内表面反相填料可以对生物和环境样品中的小分子分析物进行直接的反相或离子交换萃取测定。内表面反相填料可细分为以下几种。
    第一种内表面反相填料的制造方法是首先使甘油基丙基硅胶与一个三肽甘氨酸-L-苯丙氨酸-L-苯丙氨酸反应 ,则该硅胶外表面及其内孔表面均键合上了相对疏水性的三肽基团 ,然后再将此硅胶与羧肽酶 A反应 ,则硅胶外表面的苯丙氨酸基团被酶水解而除去 ,留下了亲水性强的甘氨酸残基和甘油基丙基;但由于羧肽酶不能进入硅胶内孔 ,因而硅胶内孔中的三肽并不能发生水解反应 ,则硅胶内孔仍保持较强的疏水性。这种内表面反相填料的孔径大约为 8 nm,它可对分子量大于 20000的大分子物质产生体积排阻功能。该萃取剂对小分子物质的萃取保留机理是硅胶内孔表面的三肽与小分子物质之间的π-π电子作用和三肽中苯丙氨酸残基的弱阳离子交换作用。自 Hagestam等提出并发展该内表面反相填料以来 ,多种分子基团被修饰到硅胶内孔的萃取分配相 ,这种类型的内表面反相填料发展最早 ,已有商品供应 ,在药物分析等领域有很多应用 ,它们可以经受多达几百次总计大约 7 mL的血清或血浆样品的直接注射 ,而其分析性能没有明显下降。 但是这种内表面反相填料的一个明显缺点是其对极性较大的一些两性水溶性药物如青霉素类和头孢菌素类的保留很差 ,或基本不保留;该类内表面反相填料对分析物萃取实验的批间精密度也不够好。也可先在硅胶上反应修饰 N-特丁氧羰基-L-苯丙氨酸、 N-乙酰基-L-苯丙氨酸、 N-苯甲酰基-L-苯丙氨酸和苯基丙酸等 ,然后再用胰凝乳蛋白酶水解硅胶外表面，使其表现良好的亲水性和生物相容性。还有一个较简便的制造该类内表面反相填料的方法是首先用 HCl溶液与烷基硅烷化硅胶反应 ,由于硅胶外表面与 HCl溶液密切接触 ,因而发生了水解反应 ,因此硅胶外表面表现良好的水溶性;而硅胶内孔则不易发生这种水解反应 ,因而表现一定的疏水性 , 这点恰好具备了内表面反相填料的条件。这种方法可以合成内表面具有 C8、 C18、 苯基或离子交换功能团的内表面反相填料。

（资料来源：蔡亚岐，牟世芬，分析化学，，2005，33（11）：647～1652