主题：【资料】色谱新技术(8讲 待续)

在分析分离方面的迂回曲折前进

                    G．Guiochon

                      Am.  Lab. 1998, Sep. 14～15



研究是一种吸引人的职业，它可以激发我们的思维, 防止我们把注意力限于辽阔的需求视野里，因为我们要全神贯注地找到解决现有问题的办法。一旦需要,我们就要暂停现在进行的研究工作，把它储备起来。目击最近30年来新技术在其他领域里大展宏图，而分析分离方面却没有得到应用，只是缓慢地演化。值得考虑一下是：在气相色谱和高效液相色谱方面的辉煌成就 ;在超临界流体色谱（SFC）和场流分离（FFF）方面的失利 ;以及在毛细管区带电泳（CZE）和电色谱方面前途未卜的现象。SFC不象灰姑娘那样，它曾三次被邀请参加“舞会”，但是未能进入舞池*。Giddings 和 Myers早在60年代就对SFC进行了先驱性的研究工作 ;第二次SFC的浪潮发生在80年代初期，并为超临界流体冠以语不惊人誓不休的“物质的第四态”的头衔，而且认定SFC将掀起分析方法的革命 ;第三次是目前又出现强化的波澜，但是目前各大公司却纷纷撤去SFC分离设备，放弃进一步发展的计划。毫无疑问SFC具有一些独特用途，但是它被挤在气相色谱和高效液相色谱之间，而GC和HPLC已成为广泛应用的技术，所以SFC命中注定处于被束之高阁的地位。

Giddings以其令人惊奇的精神，坚持不懈地开发FFF技术，他以毕生精力对FFF的理论、仪器设计使用和FFF的应用，进行研究和开发。他在60年代末开发出FFF的仪器和应用的方法，由于它在胶体，特别是在细胞分析方面的应用有巨大的潜能和魅力，使FFF保持了它成为一个非常出色的方法。在不断开发新技术的杰出专家中，Giddings是一位伟大的科学家，他吸引了许多弟子，他博学、谦逊而有节制。FFF和它的创立者一样，并不虚夸，而是静静地继续寻找在生物化学领域中更大的有待解决的问题。

毛细管区带电泳（CZE）像晴天霹雳一样诞生于80年代初，由于它具有惊人的高柱效，使许多分析化学家趋之若鹜地奔向CZE，许多色谱学家也都转向CZE，希望它能解决一切分离问题。但是许多工业分析化学家现在沮丧了，因为虽然CZE具有很高的柱效，但是它失去了色谱方法灵活调节分离因子的机动性，它难以成为定量分析的手段，CZE分析结果的偏差要比HPLC整整大一个数量级，这是一个极大的障碍。仪器制造商们眼巴巴地看着销售额的下降，而在博士生论文中仔细地研究CZE的细节，希望色谱工作者能够使用CZE。虽然人们早就想使用这一方法，但是只有它成为一个真正的定量分析方法之后才能获得广泛的应用。要解决这一困难的问题，需要付出艰辛的学术研究。如果谁能够成功地解决这一问题，必定会给以最高的酬谢。

现在电色谱（CE）成为这一领域的新秀，我希望CE能获得成功，尽管要下一个结论还为时尚早，但是CE驱动流动相的方式和CZE相同，都是使用了电渗流，这种流动速度的波动造成CZE在定量分析中的误差来源，要克服这一困难是近期具有挑战性研究任务。

有许多理由说明SFC和FFF是不够成功的，它们不能成为分析方法的主流，而CZE和CE是在苦难地挣扎之中。要使之成功和普及并成为定量分析方法必须：1.易于使用，操作费用低，2.能够得到准确、可重复的定量结果，3. 要能够解决至少一个分析化学中的重要问题。在所有这三个问题中，它的功能必须超过其他技术。在60年代的GC和70年代的HPLC就是这样的**。目前对具有竞争性方法的要求很高，从性能考虑SFC，FFF，CZE和CE由于自身弱点的缘故，处于和GC与HPLC优点进行比较的处境。SFC，FFF，CZE和CE是很重要的分析分离方法，都有自己的某些特殊的优点，具有第三个适应性，如过它们能满足其他两个要求它就会得到广泛的应用。

与此同时，在大学里对研究生们灌输的是似非而是的论点, 使他们熟练地掌握CZE技术并研究其应用方法，而工业界正在寻求色谱学家（或是GC或是HPLC）解决人们最为关心的问题。不过CZE还是具有极大的机遇，用它去分析生物大分子，只要把它的定量分析精度明显地提高，它会蓬勃发展，成为极其重要的分析方法。

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*  在80年代初，一些科学家公开讲演的题目是：“现在是SFC参加舞会的时候“，在回顾过去时，似乎这一舞会是一种排外的事件。

** 把SFC，FFF，和CZE与GC的应用相比（石油和石化产品的分析） ;和HPLC的应用相比（药物，代谢物和生物化学品的分析）

芯片上的离子色谱仪

              J．P．Murrihy  et al

        J. Chromatogr.A, 2001,924 : 233～238


1．前言

  在芯片上的分离的微型化日益引起人们的兴趣，因为它具有减少试剂消耗、改善分离性能、缩短分析时间、并可用于流程和现场分析等优点。在CE的微型化方面有大量工作发表，这是由于CE易于实现以及因其是平头流型而具有很高的柱效，使其胜过以压力为驱动的方法。即使如此传统的液相色谱技术，如高效液相色谱（HPLC）和离子色谱在例行分析中仍起着重要的作用。几乎没有液相色谱仪微型化的报道，特别是离子色谱的微型化，其难点在于要在芯片的微沟道中涂渍固定相，有人提出一些方法，包括填充法、涂渍法、连续床原位聚合法和原位整体柱填料结构微机械制作并进行衍生化的方法。在这些方法中涂渍法是最容易实现的方法，但是相比率不能达到很高。细小的微沟道和厚的固定相膜，例如使用纳米涂渍技术，可以使被分离样品与固定相有增加接触的机会，因而可以得到较好的分离。

    乳胶纳米微粒已经应用于离子色谱和毛细管电泳毛细管的涂渍，但是还没有应用于芯片上微沟道的涂渍。本文讨论在硅芯片上制作用于离子色谱的微分离色谱柱，用Pyrex玻璃片封盖刻蚀的芯片，乳胶纳米微粒用于涂渍在芯片上微机械制作的微沟道，并用以分离无机阴离子，硝酸根离子、亚硝酸根离子、和碘离子来进行测试。

2．实验部分

2．1 材料和试剂

    季铵盐乳胶微粒（AS5A型）颗粒度大约为75 nm，有Dionex公司提供，1 mM NO2¯，NO3¯，I¯ 标准溶液用分析纯的钾盐和钠盐配制。聚醚醚酮（PEEK）管、PEEK套管、螺帽、密封垫和无死体积接头从Sigma-AldrICh公司得到，熔融石英毛细管（50μm I.D. TSP050150 型; 40μm I.D. TSP040150 型）从Composite Metals公司购得。另外使用18.2MΩ Millipore纯水配制所有的标准溶液。

2．2 仪器

    使用一个Ultra Plus 微泵系统和一个20 nL手动进样器用于芯片外的泵和进样，使用岛津SPD 10Avp 检测器装有35 nL的流通池进行214 nm处的检测，用HP3392A积分仪记录色谱。使用LC-8A制备液相色谱仪的泵来涂渍毛细管和芯片微沟道。使用PEEK套管和标准无死体积接头作通道的连接。

2．3 芯片的制作

    使用以前讲述过的标准光刻技术、湿法和干法刻蚀和键合技术]芯片制作微型化液相色谱，芯片的排版设计在爱尔兰科克城的国家微电子中心（National MICroelectronIC Center）的。Sun Sparc workstation上进行。分离微沟道在4英寸的<100>取向硅晶片上用微机械法制做，用干刻蚀剂SF6以各向同性方法刻蚀成0.5–10 μm深的沟道，第二次光刻以各向异性方法在同一芯片上刻蚀成V形沟槽的连接端口，最后用阳极键合方法把Pyrex玻璃片覆盖在刻蚀的芯片上。用金刚钻处理使V形沟槽露出来，把熔融石英毛细管插到沟槽中，以不能导电的环氧树脂粘接定位。再把熔融石英毛细管用标准的LC接头与外面的仪器相连接。

2．4 毛细管和设备的涂渍

    准备要涂渍的毛细管，把注射器装在改造的“胶水枪”装置上使其形成一致稳定的压力，以 1 M NaOH冲洗毛细管30 min，然后用水洗涤毛细管，之后用上述的注射器装置把1:10 稀释的次 AS5A 乳胶悬浮液通过毛细管30 min，让此乳胶悬浮液在毛细管中停留30 min，在使用前用流动相冲洗30 min。微型化液相色谱芯片的涂渍是使用HPLC泵把乳胶悬浮液通过芯片30 min，把乳胶悬浮液留在其中30 min，然后用水冲洗它以免堵塞，在使用前用流动相进行平衡30 min。

3．结果和讨论

3.1. 在芯片上的微型化LC系统

在本研究中使用芯片的大小是 20 x 20 mm （图1），按第2节所述的方法制备出来，微柱的尺寸为 23 cm x 200μm x 3.6μm，体积为115 nL，特别适合于进行开管柱(OT)的分离，因为被分析样品通过最短的距离(1.8 mm)到达固定相。使用在芯片外进样和检测，芯片和连接管都可以看做是“分离柱”，我们所使用熔融石英毛细管（长度在4 到 15 cm之间）把芯片和进样器及检测器连接起来，熔融石英毛细管是和芯片一起用乳胶悬浮液涂渍，因此它的作用也进行测试。

3．2  开管芯片和开管（OT）毛细管柱的比较

  Pyo 等发现阳离子乳胶可以吸附在熔融石英毛细管上，他利用这种颗粒的毛细管柱以高温OT-LC分离无机阴离子。在涂渍芯片的过程中，连接管也同时受到乳胶的涂渍，因而也提供了离子交换点和被分离物质作用，为了考查熔融石英管对分离的贡献，使用一截3.5-m350-μm I.D.熔融石英毛细管涂渍AS5A乳胶微粒，检查它对所选择无机阴离子以OT-LC模式进行分离，分离情况如图 2a 所示，图中分离硫脲（中性标记物）NO3¯，和I¯，用1 mM KCl做洗脱剂。

考查总长度为 34 cm x 50-μm I.D连接毛细管和涂渍芯片的分离能力，原来的目的就是使用乳胶悬浮液简单地冲洗方法涂渍分离装置，得到成功就没有进一步地优化涂渍方法，图2b是在和毛细管同样分离的条件下，分离同一样品的色谱，唯一不同的是流速，从图上可以看出在芯片装置上样品的保留时间要比在毛细管柱上高很多， 为了比较保留值的变化，考察容量因子（k’）的变化，k’与流速的变化无关，用下式计算k’值：

          k^=tR/(tR-t0)

式中tR是被测物的保留时间，t01是保留被测物的保留时间，使用硫脲做不被保留物质，用以计算被测物的容量因子，NO3¯ 的容量因子从毛细管柱上的 0.12 到芯片的0.40，而 I 离子从0.48 到 2.27 。不必惊讶容量有如此大的增加，这是因为在芯片上微沟道中的固定相与样品有更多的作用机会，所以在芯片上可以得到很好的分离。连接芯片到离线进样和检测装置的毛细管比较长，(每端有 17 cm)，这样样品通过毛细管到检测器距离就比较长，使分析时间变长，同时也提供了样品和涂渍了固定相毛细管的作用的机会。为了矫正这一弊端把连接毛细管缩短到8 cm （每边4 cm），这是安全地连接外部设备最短的距离。从所测定数据说明缩短毛细管长度的影响，用短毛细管连接的芯片装置的无效运行时间为 0.83 min，而使用长毛细管连接的芯片装置的无效运行时间为 3.97 min，这样缩短了分离时间，对 I 的洗脱只有2.75 min, 加快了几乎 10 min 。当缩短毛细管长度后保留因子保持不变，这就说明所起的保留作用主要是芯片上微沟道涂渍的固定相，而不是连接毛细管。

3.3. 离子交换剂性能的验证    上述在芯片上吸附的乳胶微粒的离子交换性能得到对样品的分离，以及用 IC 控制保留性能的典型方法也是有用的。要完成这一任务十分容易，只要改变竞争离子的浓度即可，即增加洗脱液中阴离子的浓度就会降低样品的保留时间。为了严正这一点，使用浓度为 0.1, 0.5, 和 1.0 mM Cl¯ 洗脱液分离硫脲、NO3¯ 、 NO¯ 和 I¯，研究说明当Cl¯ 浓度降低时样品的保留值增加，所以使用 0.1 mM Cl¯硫脲、NO3¯ 、 NO¯ 和 I¯，很容易分开，按照下面的公式保留值的增加随洗脱液阴离子的浓度（E）而变化。用三种不同的阴离子样品的容量因子和三种不同洗脱液浓度做图，得到线性关系（r2 > 0.99），线性范围从NO2¯ 的 ­0.77 到 I¯ 的­0.82 ，其数值比理论预计值 ­1 要低，所以如此可能是由于空气中的 CO2 溶于未缓冲的洗脱液中，因而形成 HCO3¯ 根离子，增加了电解质阴离子的浓度，从而提高了洗脱液的洗脱强度，所以保留时间要比没有HCO3¯ 根离子时预计的低了一些，于是就会偏离x / y.= ­1的比值。

3.4. 线性和检测限

使用浓度为 0.1 mM Cl¯ 的洗脱剂，注射不同浓度的硫脲、NO3¯ 和NO2¯ 样品，把峰面积和NO3¯ 和NO2¯ 的浓度作图得到校准曲线。从图可以看出NO3¯ 和NO2¯ 在5 μM～1 mM 浓度范围内和峰面积呈线性关系，其相关系数分别为 r2=0.9944和 0.9905，NO3¯ 和NO2¯ 的检测限测定三次噪音的标准偏差为0.5 μM。

4. 结论 把乳液纳米微粒成功地涂渍到硅晶片微沟道中，并证明可以在芯片上分离无机离子，由于微机械色谱柱孔道窄小并涂渍了纳米级固定相微粒，因而在芯片样品与固定相作用的机会多于毛细管柱，从而在芯片上的分离优于在毛细管柱上的分离。希望在不久的将来把进样和检测都集成到芯片上，会使分离更好一些。

    （对不起,图片难以嵌入，就略去了，如需要可以看《国外分析仪器》杂志上2001年的译文)             

  RFu 编译

双-模式蒸发光散射检测器（ELSD）（1）
ELSD(蒸发光散射检测器)是一种很有用的HPLC检测器，它可以检测任何挥发性低于流动相的组分，可以避免UV和RI（折光指数）检测器存在的许多问题。因为ELSD的响应不依赖与样品的光学性质，可以检测任何挥发性低于流动相的组分，不论它具有何种官能团。对所有样品的检测几乎具有相同的响应因子，对未知物和纯度的测定要比UV检测更容易更准确。因为ELSD的检测是在流动相被蒸发之后进行的，所以在梯度洗脱过程中基线很稳定，没有在RI和低波长UV检测中来自溶剂峰的干扰。ELSD已经广泛地用于多种化合物的检测，碳水化合物、药物、营养药物、类脂物、三甘油脂、未衍生化脂肪酸和氨基酸、聚合物、表面活化剂和组合数据库。

为了得到优化的灵敏度和稳定的基线需要使用两种操作模式

    ELSD的检测原理包括三个简单的步骤。首先从色谱柱中洗脱出来的组分和惰性气体混合，产生出包含流动相和样品的气溶胶。其次，作为气溶胶的流动相在通过加热的漂移管时被蒸发掉。最后，留下来的不挥发性样品颗粒和流动相蒸气通过一个光检测池，暴露在光照之下，用光传感器测定样品的散射光产生电信号，信号与样品的质量成比例关系。所有的商品检测器都具有通商的过程，但是如前所述，它们具有不完全相同的结构，在一种ELSD的设计中（A型，也叫做非气溶胶分流型），所有的气溶胶流体都通过漂移管并进入光检测池。而另外一种形式的ELSD（B型，也叫做气溶胶分流型），把一部分气溶胶分流放空排放到外面，剩余的气溶胶通过漂移管和光检测池进行检测。使用A型或B型ELSD可以得到好的结果，这要决定于样品的性质。

    A型ELSD通常使用比较高的操作温度，这是因为要把所有的气溶胶气流蒸发，当样品是非挥发性的在操作温度下就要把流动相蒸发为蒸气。A型ELSD要更灵敏一些，因为全部样品都进入光检测池进行检测，但是如果在操作温度下样品是挥发或半挥发性的，在这一温度下才能使流动相挥发，那么部分甚至全部样品都会随流动相挥发，大大减少检测器的信号。在这种情况下，采用 B型ELSD，在低的操作温度下效果最好，涉及到流动相，A型ELSD能够顺利地蒸发高有机物含量和低流速含水流动相。在使用高流速的流动相以及在使用陡峭的程序时，需要使用B型ELSD把气溶胶分流，这样可以有利于蒸发并使基线稳定。

  为了在所有的应用中得到优化的灵敏度和稳定的基线，在一台仪器上一种ELSD需要有两种类型的操作模式，到目前为止还没有在一台仪器上有两种类型的ELSD。这种双模式仪器只能是买一台气溶胶分流装置安装到A型ELSD的检测器上。

双-模式ELSD：广泛应用的性能优化(2) 

实验部分

试剂

    去离子水使用Millipore水纯化系统，HPLC-级的溶剂是从Burdick 和Jackson公司购得。调节剂是从Sigma公司买来，碳水化合物、对羟基苯甲酸酯类、药物和吡喃葡萄苷标准样购自Sigma公司和Aldrich公司。

ELSD 2000在一台仪器上结合了类型A和类型B两种操作模式，这样优化的性能可以获得广泛的应用

仪器

在一台包含有525型双梯度泵和在线脱气装置和530柱加热箱的液相色谱仪上进行色谱分析，使用570或580型自动进样器，ELSD2000型检测器，所有的仪器均来自Alltech公司，数据收集采用安捷伦科技公司的HP化学工作站，或PE公司的Turbochomä EL数据工作站。

色谱柱

本工作使用下列的色谱柱：

Econosphere äC18, 5 μm, 150 x 6.5 mm ; 700 CH Carbohydrate, 10 μm, 300 x 6.5 mm ;和Alltinaä C18, 5 μm, 150 x 4.6 mm ;  5 μm, (全部来自Alltech公司)

结果和讨论

在ELSD 2000一台仪器上结合了类型A和类型B两种操作模式，这样优化的性能可以获得各个方面的应用，双模式的操作利用先进的气溶胶处理技术（专利技术）来完成，使用两个柱塞的杜邦（DuPont）带TeflonÒ涂层的不锈钢撞击取样器置于漂移管和雾化器之间的几英寸处，具体多少决定于应用的情况，ELSD可以在撞击取样器打开（on）或关闭（off）的模式下工作。

在关闭（off）的位置时，撞击取样器定位和气溶胶流路通道平行，全部气溶胶使撞击取样器旁路，流体通过漂移管，并进入光检测池进行检测，当撞击取样器处于关闭（off）状态时，是仿效类型A的操作方式。当撞击取样器处于打开（on）状态时，它定位和气溶胶流路垂直，大的气溶胶颗粒撞击到撞击取样器上形成一个液体流通过废液管排出，剩余的气溶胶绕过撞击取样器通入漂移管，并进入光检测池进行检测，所以撞击取样器处于打开（on）状态时，是仿效类型B的操作方式。

撞击取样器处于关闭（off）状态时，对非挥发性样品和/或对较易挥发的流动相（有机组分很多）可以得到最大的灵敏度。图2 a 和 2 b是在撞击取样器处于关闭（off）和处于打开（on）状态时分析吡喃葡萄苷检测结果的比较。撞击取样器处于关闭（off）状态时，灵敏度最高，这是因为溶质是不挥发性的，而90/10的甲醇/水在70℃条件下很容易挥发。而在撞击取样器处于打开（on）状态时，一部分气溶胶分流排放到废液管中，其灵敏度自然降低了。




图 2  在撞击取样器处于“off”（a）和”on”(b)时分离吡喃葡萄苷

        温度：（a）70℃，气体流速：2.0 L/min

              (b) 40℃，气体流速：1.5 L/min

        色谱峰：1—n-癸烷基β-D吡喃葡萄苷，2-- n-辛烷基β-D吡喃葡萄苷。

                3--n-十二烷基β-D吡喃葡萄苷

        色谱柱：Econosphere äC18, 5 μm, 150 x 4.6 mm

        流动相：甲醇：水（90：10）,  流速：0.8 mL/min

        检测器：ELSD 2000

双-模式ELSD：广泛应用的性能优化(3) 

双-模式操作使ELSD成为更有力和更灵活的检测器

    碳水化合物（糖类）是不挥发性化合物，在“off”模式下进行分析极为有利，图3a是在“off”模式下分离和检测碳水化合物的结果，虽然流动相是100%的水相，流速为低达0.5 mL/min，但是在“off”模式下很容易使流动相挥发。与此相反，在”on”模式下（图3b）灵敏度很低，这是由于在”on”模式下一部分气溶胶分流排放到废液管中。可是在”on”模式下对水含量高的流动相很有效。如果样品是不挥发性的或流速低于1 mL/min时不一定需要使用分流气溶胶的方式。




图 3  在撞击取样器处于“off”（a）和”on”(b)时分离碳水化合物

        温度：（a）95℃，气体流速：3.0 L/min

              (b) 40℃，气体流速：1.5 L/min

        色谱峰：1—蜜三糖，2—乳糖, 3—葡萄糖，4—甘露糖

        色谱柱：700 CH Carbohydrate, 10 μm, 300 x 6.5 mm

        流动相：100% 水 ,  流速：0.5 mL/min , 柱温：90℃，

        检测器：ELSD 2000



    对半挥发性样品和/或挥发性差的流动相（即含水量高的流动相）要获得最高的灵敏度，包括使用陡峭的反相梯度，必须要使用撞击取样器处于“on”的模式。例如对羟基苯甲酸酯类是半挥发性化合物，使用撞击取样器处于“on”的模式可以得到很好的结果，图4a是用撞击取样器处于“on”的模式下分析对羟基苯甲酸酯类的色谱图。虽然在撞击取样器处于“off”的模式下绝大多数有机流动相可以很容易挥发掉，但是需要在高温下把流动相挥发的同时半挥发性样品也会挥发一部分，因此大大降低了灵敏度，如图4b所示。



图 4  在撞击取样器处于“on”（a）和”off”(b)时分离对羟基苯甲酸酯类

        温度：（a）105℃，气体流速：2.3 L/min

              (b) 32℃，气体流速：1.5 L/min

        色谱峰：1—对羟基苯甲酸甲酯 ，2—对羟基苯甲酸乙酯,

                3—对羟基苯甲酸丙酯，4—对羟基苯甲酸丁酯

        色谱柱：Alltinaä C18, 5 μm, 150 x 4.6 mm ;  5 μm

        流动相：100% 乙腈：水（60：40） ,  流速：1.0 mL/min ,

        检测器：ELSD 2000



图5是使用水性流动相在陡峭的洗脱梯度下分离药物的色谱，在此情况下使用撞击取样器处于“on”的模式，因为样品是半挥发性的而流动相是难挥发性的。凡是在陡峭的和/或高速的洗脱梯度下一定要使用“on”的撞击取样器模式，例如在组合化学中的应用。

    撞击取样器位置可在ELSD 2000的前面板上进行选择，或者通过RS232遥控通信进行选择。这也是在一台仪器上进行ELSD双-模式操作无与伦比的先进系统，可以在两个模式之间进行简单快速地转换。



图 5  药物的分离

        色谱峰：1—茶碱，2—阿斯匹林, 3—三甲丙咪嗪

        色谱柱：Alltinaä C18, 5 μm, 150 x 4.6 mm ;  5 μm

        流动相：A  0.1% 三氟乙酸（TFA）水溶液

                B  0.1% TFA 在乙腈中的溶液

        梯度：时间（min）=0  B%=10

              时间（min）=16  B%=90

        流速：1.0 mL/min ,

        检测器：ELSD 2000

        撞击取样器处于“on”的模式

        温度：40℃

        气体流速：1.5 L/min

结论

    ELSD双-模式操作使其更为有效和便利，而且可以对任何化合物进行检测。无论是任何样品的类型和操作条件，ELSD 2000对所有的样品都可以提供最高的灵敏度和最稳定的基线。撞击取样器处于关闭（off）状态时，对非挥发性样品和有机物流动相或低流速的水性流动相，可以得到最大的灵敏度。当撞击取样器处于打开（on）状态时，对半挥发性化合物或使用高水含量的流动相在高流速下洗脱，包括使用陡峭的和/或高速梯度洗脱，可以得到最佳的灵敏度和最稳定的基线。

揭示生命奥密的重要仪器——色谱仪

提到色谱仪对不从事化学有关问题的人来说可能还有些陌生，但是“色谱”一词的出现已经有近100年的历史了，而且从现代科学技术意义上说的商品色谱仪的使用也有近半个世纪了。色谱方法和色谱仪科学技术的发展、为国民经济的增长、为人民的健康长寿、特别是为揭示生命奥密作出了卓越的贡献。

俄国植物学家茨维特茨维特于1903年在波兰华沙大学研究植物叶子的组成时，他巧妙地用碳酸钙作吸附剂，分离植物干燥叶子的石油醚萃取物，他把干燥的碳酸钙粉末装到一根细长的玻璃管中，然后把植物叶子的石油醚萃取液倒到管中的碳酸钙上，萃取液中的色素就吸附在管内上部的碳酸钙里，再用纯净的石油醚洗脱被吸附的色素，于是在管内的碳酸钙上形成绿、黄等三种颜色的六个色带,分离了叶绿素、叶黄素和胡萝卜素。当时茨维特把这种色带叫作“色谱”，茨维特把他开创的方法叫色谱法，或者后来人们把这一方法叫做液-固色谱发。在这一方法中把玻璃管叫作“色谱柱”，碳酸钙叫作“固定相”，纯净的石油醚叫作“流动相”。这是利用色谱方法为探究生命现象的启蒙和开端。

在茨维特提出色谱概念后的20多年里没有人关注这一伟大的发明。直到1931年德国的库恩等才重复了茨维特的某些实验,用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-, 和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素，1938年他从维生素 B 中分离出 B 6，由于他的出色研究而获得了1938年的诺贝尔化学奖。这是利用色谱方法为探究生命现象、了解生物物体构成的初步尝试。接下来在40年代到50年代初，英国的生物化学家马丁等在研究生物体重要组成脂肪酸和脂肪胺时开创了以气体作流动相以液体做固定相的气-液色谱法，因而获得了1952年的诺贝尔化学奖。1958年美国生物化学家 Stein 和 Moore 研制出氨基酸分析仪，用它确定了核糖核酸酶的分子结构，后来氨基酸分析仪成为研究蛋白质和酶结构的重要工具，Stein 和 Moore 因此而获得了1972年的诺贝尔化学奖。

从上面的几件历史事件看出色谱分离方法和色谱仪是为揭示生命奥密而出现的。而在20世纪末的人类基因组计划的提前完成和21世纪初蛋白质组学的大力开展，色谱方法和色谱仪又作出了令人鼓舞的贡献。

2000年6月宣布人类基因组计划已经完成了其工作草图，因此，科学家们认为，生命科学已经进入了功能基因组(后基因级)时代，在功能基因组时代，生物学家们的研究重心从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。2001年2月12日，中、美、日、德、法、英等6国科学家和美国塞莱拉公司今天联合公布人类基因组图谱及初步分析结果。这一计划所以能够提前完成，其主要原因之一就是使用了高通量的阵列毛细管电泳仪，这一仪器是也是一种属于色谱仪范畴的仪器。

从基因组DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组学（Proteome）研究中找到答案。在所研究的细胞中会有3—5万种蛋白质，目前蛋白质组研究所使用的双向电泳一般只能分辨到2000—3000个蛋白质点。在蛋白质组的分析中有望用高效液相色谱作预分离，即使用双向HPLC，第一向是体积排阻色谱。所以双向电泳和高效液相色谱将成为蛋白质组学的重要分离工具。所以色谱仪将为深入地揭示生命奥秘作出更大的贡献。

从色谱出现的百年历史说明，色谱仪是揭开生命奥秘的有力工具。色谱仪大致包括气相色谱仪、高效液相色谱仪、离子色谱仪、超临界流体色谱仪、毛细管电泳仪等等。前两种色谱仪是应用最为广泛和应用十分成功的两类仪器，可以分析气体、液体、固体等复杂混合物。离子色谱仪也逐渐普及地用于各个领域。超临界流体色谱仪应用范围较小还不普及。毛细管电泳仪是20世纪80年代后发展起来的一种高效分离仪器在生命科学领域有极大的应用前景.

用纳米填料的高效液相色谱

Anal. Chem. 2002,74（16）（Aug.15 出版）:704 A


要使 HPLC 的分析时间缩短，提高分析通量，一个有效的办法就是减小 HPLC 色谱柱填料的直径，这样作容易吗？的确不容易，因为减小 HPLC 色谱柱填料的直径会使柱压降大大提升。 New York–Buffalo State University 的Luis Colón 和José Cintrón 制备出一种有机硅胶的纳米填料，用于超高压高效液相色谱 (UHPLC) 。这种有机硅胶纳米填料是使用溶胶-凝胶一步法制备出来的，其直径很均匀，670-nm (±40 nm)。这种纳米填料可以用于常规压力为 5000 psi 的高效液相色谱，也可以用于压力为 50000 psi 的超高压高效液相色谱（UHPLC）。使用这一纳米填料色谱柱可以大大缩短分析时间，例如分析抗坏血酸、对苯二酚、间苯二酚、儿茶酚和愈创木酚的分析时间由 25 min 缩短到 ~3 min ，色谱柱柱效从130,000 到 500,000 plates/m。（原文见：Analyst 2002, 127, 701–704）

气相色谱吸附剂固定相的历史就只有那么几个吗

要使 HPLC 的分析时间缩短，提高分析通量，一个有效的办法就是减小 HPLC 色谱柱填料的直径，这样作容易吗？的确不容易，因为减小 HPLC 色谱柱填料的直径会使柱压降大大提升