主题：【资料】气相色谱手性分离(71讲 待续)

气相色谱手性分离 (2)

手性化合物的基本概念

为了更好地理解手性分离，在研究气相色谱手性分离以前，我门先要把手性化合物的概念复习一下。

有机化合物中的立体结构异构[1]

立体结构异构是指其分子式相同，构造相同．而分子内的原子在空间徘布的

位置不同，立体结构异构的类型有：

    （1）顺反异构

    顺反异构是指由于共价键的旋转受到阻碍而产生原子在空间排布的位置不同。顺、反-2-丁烯。

    （2）构象异构

    构象异构是指由于分子内单链旋转位置不同而产生的异构体，因此这种异构可以通过单键旋转而互相转化。一个化合物往往是处在各种构象异构的动态平衡中，而最稳定的构象存在的几率最大。

    (3)立体异构

    立体异构是由于分子内手征性碳原子所连接的4个不同基团在空间排列顺序不同而产生的异构体．立体异构和顺反异构与构象异构不同，它们不能在没有键的断裂情况下，由于键旋转而互相转化，这种立体结构称为构型．所以立体异构体与顺反异构体都是由于构型不同而产生的异构体。

    在立体异构．顺反异构与构象异构中，凡是和它的镜像不能重合的异构体可以有旅光性，

称为旋光异构或光活性物质．一对互为镜像而又不能重合的异构体称为一对对映体。因此立

体结构异构若从有无光学活性的角度来看，又可分成两大类有旋光性的和无旋光性的立体结构异构。

    构造、构型、构象及旋光异构之间的关系是，具有相同的构造可以有不同的构型；具有相同的构型可以以不同的构象存在；具有相同的构造，但由于构型或构象的不同产生的异构属于立体结构的异构，凡是立体结构的异构中，与它的镜像不能重合的叫旋光异构。旋光异构体也叫做手性异构体。





[1]蒋硕健，丁有骏，李明谦. 有机化学(第二版)，北京大学出版社，1996年

气相色谱手性分离 (3)
气相色谱法分离手性化合物的特点(1)

    色谱法的特点主要是它能够把复杂的混合物分离为各个组分，并逐个检测出来．色谱法效率很高，能分离性质只有微小差别的纵分．但是在对手性化合物的映体之间，除了偏振光的偏转方向不同以外，其它理化性质如蒸气压、溶解度等，在非手性环境中几乎完全相同，因此，不能用简单的以蒸馏、结晶等方法进行分离，也就是说不能用一般的色谱法对其进行分离。对映体拆分一直是色谱分析中的难题，吸引着众多研究者的兴趣。要在色谱仪上进行对映体分离，必须引入一定的手性环境，目前，有两种方法可以选择．第一是使用手性试剂的间接法，第二是使用手性固定相的直接法。

(一)间接法

    与化学拆分法原理近似，让待分析的对映体与手性试剂反应，利用所生成的非对映异构体理化性质的差别，在非手性固定相上进行分离。

    外消旋的醇、胺、羧酸、羟基酸和氨基骏等部可用该法进行分离．常用的手性试剂有手性醇、胺、N(O)-全氟代酰基的羟基酸酰氯或氨基酸酰卤等．

    间接法是先形成非对映异构体，然后利用非对映异构体在沸点、溶解度上的差异进行分离，其应用有很多缺点，主要表现在：

    (1)  需要旋光纯度高的手性试剂；

    (2)  消旋体和手性试剂需具有匹配的功能团；

    (3)  生成的非对映异构体需具有足够大的差异，并在色谱条件下

足够稳定；

  〔4)  反应过程可能伴随消旋和降解等副反应，给定量分析造成困难．



(二)直接法

    直接法分离对映体是在手性固定相上进行．其原理是通过待拆分对映体与手性固定相之间的瞬间可逆相互作用，根据形成瞬间缔合物的难易程度和稳定程度，经过多次平衡以后，达到对映体的分离．直接法克服了间接法的许多缺点，近年来已取得了令人瞩目的进展，我们主要对直接法进行较详细的讨论．

[1] 周良模等，气相色谱新技术，科学出版社，1994

气相色谱手性分离 (4)



手性化合物直接分离的历史透视 



    用 gc 在手性固定相上进行手性化合物的分离是由 Gil-Av 等人在以色列的Weizmann Institute of Science 于 1966 首先开发的（ E. Gil-Av, B. Feibush, R. Charles-Sigler, Tetrahedron Lett.(1966) 1009.）。有关gc的手性分离在上世纪60年代开始时的情况Gil-Av回顾时这样描述的（ E. Gil-Av, J. Mol. Evol. 6 (1975) 131.）。

“当我们在1964开始这一研究时，这一工作处于‘受挫状态’，没有人相信这一工作是可以做的，实际上很多人深信D-型和L-型溶质在不对称溶剂中具有明显不同的作用力，这是人们已有的感觉，即使是敢于想象的人也如此，因为有不少研究报告发表，这一观点是无可辩驳的，但是没有人重复这些结果，而且他们当中的一些人肯定是错误的。”



  对这一问题的解决Gil-Av问题叙述如下：

“当我们开始这一工作时，B. Feibus 有勇气把这一课题作为他的博士论文的题目，我们的自信来源于下面两个基本概念：首先，自然界可以进行手性识别，酶可以区分对映体，所以我们也合成一个固定相，使其具有类似酶的性质，至少它应该有酶的基本性质，另一方面我们在一个不对称中心原子上连接一个–CO– 和 –NH–基团，实际上是一个氨基酸的衍生物。第二，我们合乎逻辑地认为，加强色谱柱的分离能力，几使用长的毛细管柱，增加理论塔板数。因为不锈钢毛细管比较贵，我们要使用很多的毛细管柱，所以决定自己拉制毛细管柱，涂渍固定相。“

    在 1967 年Gil-Av 和 Feibush 还使用填充 gc 半制备性分离了氨基酸，使用了脱机手性光学检测器，确证把手性化合物分离开了（E. Gil-Av, B. Feibush, Tetrahedron Lett. 1967，3345.）

    从 Gil-Av 的开创性工作开始到上世纪末用 gc 分离了 22000 手性个化合物，有 2200 片文献发表。（B. Koppenhoefer, GIT Labor-Fachzeitschrift， 1998，42：716.）



（资料来源于Volker Schurig,J．Chromatogr. A, 2001, 906 :275–299）

气相色谱手性分离 (5)

gc 能进行手性分离的范围

高效、灵敏和快速分离是用高效毛细管气相色谱（ HRgc ）进行手性分离的优点，由于 HRgc 具有超凡的分离能力，因而可以把样品中的污染物和杂质分离出来，同时可以把手性化合物中的多种成分同时分离开，例如一次可以把蛋白原的20 种氨基酸分离开，见图5-1。



图5-1 同时分离 20 个蛋白原中氨基酸的气相色谱图

色谱柱L：20 m x 0.3 mm ID boli1 毛细管柱

固定液： Chirasil-Val 4  0.13 μm 膜厚

样品衍生化为N,O,S-五氟戊醇基- O-2-丙基酯（组氨酸是N-乙氧基羧酸酯）im N Engl. 17 (1978) 363.

D-对映体先出峰，L-对映体后出峰，

（E. Bayer, Z. Naturforsch. 38b (1983) 1281.

V. Schurig, M. Juza, M. Preschel, G.J. Nicholson, E. Bayer,Enantiomer 4 (1999) 153.）



结合辅助技术如多维色谱和gc/MS 联用可以用于手性化合物确认，使用gc-MS 的选择离子检测（SIM）可以检测复杂基质中存在的少量手性化合物。通用型的火焰离子化检测器有很宽的线性范围，使用 ECD 有很高的灵敏度可以监测到皮克物质。使用 gc 进行手性化合物的分析主要用于精确测定所研究化学品、化学反应的中间产物、助剂、代谢物、药物、农药、杀真菌剂、除草剂、信息素、香料和调味品当中的对映体。在不对称合成中的对映体过量值（ee-值）的测定使用 gc 也是很方便的。在不需要衍生化的手性样品测定中 gc 更为方便，例如使用顶空 gc 可以更为方便地进行测定复杂组分当中的对映体。

    但是，gc 要求必须是可以挥发、热稳定性好的样品，从而也限制了用gc 进行手性分离的范围。


（Volker Schurig,J．Chromatogr. A, 2001, 906 :275–299）

气相色谱手性分离 (6)



. gc 手性固定相的分类

按照样品和固定相的作用模式可以把gc手性固定液分为三类：

1．氢键型

2．配位型（coordination）

3．包含型（inclusion）

（P. Schreier, A. Bernreuther, M. Huffer, Analysis of Chiral Organic Molecules, Wａｌｔｅｒ de Gruyter, Berlin, 1995.，

W.A. Konig, Trends Anal. Chem. 1993，12：130.）



·  利用氢键型作用力在手性氨基酸衍生物固定相上分离氨基酸对映体。

(H. Frank, G.J. Nicholson, E. Bayer, J. Chromatogr. Sci., 1977,15：174.)

·  利用形成配位络合物在配位型固定相上分离金属配位型对映体。

（V. Schurig, J. Chromatogr. 1988，441：135.）

·  利用形成包含化合物在包含型固定相（环糊精衍生物）上分离对映体。

（V. Schurig, J. Chromatogr. A 1994，666：111.）

在开始时手性选择剂（固定液）使用纯液体，或者在角鲨烷或聚硅氧烷中的溶液，为了提高色谱柱的柱效和选择性，就把手性选择剂键合到聚硅氧烷链上，变成聚硅氧烷型手性固定相（Chirasil-type），这样一来大大提高了热稳定性、柱效和耐用性。

1978年合成了聚合物手性固定液，即把L-缬氨酸-特丁酰胺接枝到聚硅氧烷上，商品名“Chirasil-Val”，见图 6-1 。这一固定液可以使用到 220℃。特别适用于氨基酸手性异构体的分离，对手性胺类、氨基醇类、α-羟基基酸酰胺类的分离。



（Volker Schurig,J．Chromatogr. A, 2001, 906 :275–299）



图 6-1  “Chirasil-Val” 的结构式

气相色谱手性分离 (7)



“Chirasil-Val” 手性固定相的延伸



一．以OV-225为基体手性固定液的合成和毛细管柱的制备及应用（1）

1977 Frank 年合成了聚合物手性固定液，即把L-缬氨酸-特丁酰胺接枝到聚硅氧烷上，商品名“Chirasil-Val” ( J.Chromatogr. Sci., 1977 15:174), Verzele  在1979年利用OV-225 固定液作基体又制备了类似于“Chirasil-Val”的聚硅氧烷手性固定液，他门的合成方法如下：其合成路线如图 7-1



图 7-1  合成路线

这是一种热稳定性好的手性GC固定相，它和前面讲的 “Chirasil-Val” 类似但是连接L-缬氨酸丁酰氨的间隔臂是三个碳，另外在聚硅氧烷链上有苯基，这样一来其保留性能和热稳定性不同于“Chirasil-Val”。这一新固定液的结构如图7-2。



  图7-2  以OV-225为基体的手性固定液



（T.Saeed,et al., J. Chromatogr.1979,186:611-618）

气相色谱手性分离 (8)

以OV-225为基体手性固定液的合成和毛细管柱的制备及应用（2）



以OV-225 固定液做基体，把它的氰基水解为羧基，在把水解后的OV-225 酰氯丙基，利用此OV-225 上的酰氯丙基和L-缬氨酸丁酰氨反应，得到所需要的固定相。

1． 酰氯丙基甲基苯基聚硅氧烷的制备

      把OV-225（1-10g）溶解到乙醚中，把氰基水解为羧基，这一反应用IR跟踪检测，直到反应完全，让氰基转变为羧基（从2270 cm-1到1730 cm-1）。得到的羧基 OV-225 1g 溶解到 50mL 干燥的苯中，在冰盐浴中冷却此混合物，往混合物中滴加3 mL 新蒸馏的乙二酰氯，并不断进行搅拌，把氯化氢蒸发之后把混合物回馏 1 h ，这样羧基就定量地转化为酰氯基（用IR跟踪检测，从17300 cm-1到1815 cm-1）。

2．L-缬氨酸-特丁酰氨的制备

  往0.01 mol  (1.17g) L-缬氨酸溶解到20mL 水中的溶液加入 0.1 mol  氢氧化钠溶液直到pH 到 10，把此混合物置于冰盐浴中冷却，加入0.01 mol  (1.7g)苯甲酰氯，把苯甲酰氯溶解在乙醚中，一滴一滴地加入，在反应过程中加入0.1 mol  氢氧化钠溶液让pH 保持在 10，继续进行搅拌让pH 保持恒定，用乙醚把未反应的苯甲酰氯萃取掉，把水层酸化到pH 2，并用乙醚进行萃取，用水洗涤萃取后的乙醚溶液，用硫酸镁干燥乙醚溶液后把乙醚蒸发掉。把衍生化的氨基酸或叫Z-氨基酸溶解到 20mL 干燥的四氢呋喃中。加入1个当量 ( 2.47g) 的N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1，2-二羟基喹啉（EEDQ），在室温下搅拌此混合物 1 h,然后加入1个当量 ( 0.73 g) 的特-丁胺，在室温下搅拌此混合物 30 min ,之后回馏2~3 h , 一直到沉淀完全溶解，把反应混合物冷却，用 0.1 mol 盐酸和水洗涤，除去未反应的胺和喹啉。溶剂蒸发掉，在正-己烷-氯仿（9：1）中进行重结晶。把闭环的L-缬氨酸-特丁酰氨溶解在无水甲醇中（30 mL），加入几滴冰乙酸，此混合物和 1 g 10% 的Pd/C 在室温下搅拌3 h ，同时让氢气在溶液表面吹拂，待反应完成后把反应物过滤，并把甲醇蒸发掉，释放出来的胺用0.1 mol 盐酸萃取，用NaOH 使胺再次析出，用氯仿萃取析出的胺，并进行干燥，在异辛烷中重结晶L-缬氨酸-特丁酰氨。产率 60%，熔点：48℃。



（T.Saeed,et al., J. Chromatogr.1979,186:611

气相色谱手性分离 (9)

以OV-225为基体手性固定液的合成和毛细管柱的制备及应用（3）

3. 氯丙酰基甲基，苯基甲基聚硅氧烷和L-缬氨酸-特丁基酰胺反应

把氯丙酰基甲基，苯基甲基聚硅氧烷在冰盐浴中冷却，一滴一滴地加入过量的L-缬氨酸-特丁酰氨乙醚溶液，把混合物搅拌 30 min，用 0.1 mol 盐酸萃取过量的缬氨酸试剂，乙醚层用水洗涤并用硫酸镁干燥，把溶剂除去。用红外吸收谱带和NMR检测L-缬氨酸-特丁基酰胺的存在。

4．涂渍毛细管柱

  用0.2% 合成的固定液二氯甲烷溶液以静态法涂渍，或用4% 合成的固定液溶液以动态法涂渍，两种办法都可以得到 0.2 µm 膜厚的毛细管柱。

5.  16 种氨基酸对映体的分离



图9-1 是用这一固定相涂渍的玻璃毛细管柱分离16种氨基酸对映体的色谱图。


图9-1  用OV-225为基体的手性固定液分离氨基酸对映体的色谱



                    色谱条件：22 m x 0.25mm I.D.径须玻璃毛细管柱涂渍OV-225为基体的手性固定液，程序升温，

                    速度为 2 ℃/min ，从 90 ℃ 到 190 ℃。进样口和检测器 250 ℃，载气为氢气，

          流速 50 cm/s

所分离的氨基酸依次为缬氨酸、苏氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸和色氨酸。

（T.Saeed,et al., J. Chromatogr.1979,186:611-618）

气相色谱手性分离 (10)

以OV-225为基体手性固定液的合成和毛细管柱的制备及应用（4）



OV-225为基体手性固定液的热稳定性和分离能力

1．热稳定性

这一固定相由于有聚硅氧烷骨架，具有较高的热稳定性，可以在 90~190℃之间进行程序升温分析。这样就可以使高和低挥发性的氨基酸衍生物在一次分析中完成，如果使用20~25 m 毛细管柱可在 50 min 内完成分析。

色谱柱在头一次老化时，容量因子略有下降，第二次再在本 230 ℃ 下老化一小时，容量因子就没有再下降。在中等粗糙化处理的色谱柱（如用沉积氯化钠）涂渍这种固定液，程序升温的最高温度可以到 180 ℃。



2．固定液的极性和分离能力

这一固定液由于在聚硅氧烷链上有苯基，不同于“Chirasil-Val”（没有苯基），所以它们的流出次序有所不同。氨基酸的N-五氟丙酰基（N-PFP）异丙酯衍生物的流出次序就反映了它们极性的差别，在OV-225改性的手性固定液上甘氨酸在异亮氨酸后流出，脯氨酸在丝氨酸后流出，而胱氨酸在天冬氨酸之前流出。

为了比较这一固定液的色谱行为，把一些氨基酸的N-三氟乙酰基-（N-TFA）D，L-氨基酸异丙酯和正丁酯，N-五氟丙酰基（N-PFP）-D，L-氨基酸异丙酯和正丁酯，和N-七氟丁酰基-（N-HFB）D，L-氨基酸异丙酯和正丁酯进行分离。用程序升温进行分离，从 90 ℃-190℃，以 2℃/min 进行升温，流出时间列于表10-1中。这些数据说明N-PFP-氨基酸异丙酯和N-HFB-氨基酸异丙酯衍生物比相应的N-TFA衍生物有更大的挥发性。但是N-TFA氨基酸异丙酯衍生物有更大的对映体选择性。图 10-1 比较了六个氨基酸的N-TFA-和N-PFP-异丙酯衍生物的分析，说明D，L-天冬氨酸对映体N-TFA-异丙酯衍生物得到基线分离。



    表 10-1 一些D，L-氨基酸不同衍生物在OV-225改性的手性固定液色谱柱上的调整保留时间





图 10-1 六个氨基酸的N-TFA-和N-PFP-异丙酯衍生物的分离

气相色谱手性分离 (11) 

二．以XE-60为基体的手性固定液的合成和分离对映体

Koennig 利用XE-60 为基体制备了几种手性聚硅氧烷固定液，图11-1就是其中的一个。他的合成方法是把 XE-60 聚硅氧烷上侧链氰烷基以碱性水解的方法，转变成羧基，然后和L-缬氨酸-(S)-α-苯基乙酰胺反应，生成XE-60 改性的手性固定相（图11-1）。




图11-1  XE-60 为基的手性聚硅氧烷固定液

这种固定相，据作者的研究认为不仅可以分离氨基酸的对映体，而且首次分离了三氟乙酰基碳水化合物和葡糖苷（W.A.König，Angew Chem. Int. ed., 1981,20:693）。XE-60 为基的聚硅氧烷固定液与 (R)-α-苯基乙酰胺基形成的非手性异构体固定相对三氟乙酰基氨基醇有很高的选择性。氨基醇是在自然界中肽抗体中的组分。这种固定相还对戊糖对映体有很好的选择性。利用这种固定相分离醇类对映体的色谱如图 11-2 所示。



图 11-2  XE-60 为基的手性聚硅氧烷固定液分离醇类对映体