主题：【资料】兴奋剂类分析方法系列讲座(40讲 待续)

兴奋剂类分析方法系列讲座（14）香港医院提醒新毒品－佐匹克隆的滥用和成瘾倾向

佐匹克隆的滥用和成瘾倾向



摘 要

关于佐匹克隆(zopiclone)的滥用和成瘾倾向一直以来都有许多的争论，本回顾性研究的目的在于:探讨过去9 a在我们诊疗所就诊病例中佐匹克隆滥用的普遍程度及其成瘾倾向。回顾病案记录，发现共有87例确诊为佐匹克隆滥用的病人。在过去的4 a中，滥用病例增长迅猛。这是到2004年为止关于佐匹克隆滥用的病例数目最多的研究报告



本文由香港青山医院屯门物质滥用诊疗所的林明研究员通过收集积累所撰写，呼于国人要提高警惕，这是一种还没有被引起注意的“新毒品”，它已悄悄向人们袭来。



前 言

失眠是大众常遇到的问题，无论是专科或普通科的执业医师，都不得不面对这个问题。自上世纪60年代起，苯二氮卓类镇静催眠药在很大程度上取代了巴比妥类镇静催眠药。随着经验和证据的累积，苯二氮草类的副作用，特别是其潜在的滥用和成瘾性均被记录在案[1,2]。第三代镇静催眠药，又称Z一药 [佐匹克隆(zopiclone)，唑吡坦(zolpidem)和扎勒扑龙(zalePlon)]，在市场上被介绍为是一种有效治疗失眠症而又没有成瘾性和引起戒断症状的药

物，使开处Z一药处方变得非常盛行。从2001年6月至2002年6月，在欧洲和日本，共开处了6.64亿片佐匹克隆 (资料来源:Sanofi一Synthelabo，Paris)。

佐匹克隆是一种非苯二氮卓类镇静催眠药，但有报道指其具有类似苯二氮卓类的镇静、抗焦虑、肌肉松弛和抗惊厥的作用。从化学上讲，它属于环吡咯酮类 (cyclopyrrolone)，它与γ-氨基丁酸部分的受体中的苯二氮卓类受体相结合。口服后被胃肠道迅速吸收，1~1.5h后在血浆中的浓度达到高峰，其口服的生物利用度接近80%。 45%~80%与血浆蛋白相结合并广泛地分布全身。它在唾液中的浓度比在血浆中的高，其味苦的特点与在唾液中的浓度是相应的[3] 。它同样会分布到母乳中[4] 。它主要在肝脏进行代谢，经过去碳酸基后变成两种主要的代谢产物：一种是不太活跃的佐匹克隆-N-氧化物(一次剂量的11%~15%)，另一种是惰性的N一去甲基佐匹克隆(一次剂量的15%~20%)。一次剂量中的约50%被衍变成其他不活跃的代谢物。代谢物主要(80%)经肾脏排出，在尿液中只有约5%的未经代谢的药物。药物排出的半衰期为3.5~6.5h。常用的剂量是7.5mg，睡前服用，但老年病人应该从3.75mg开始[5] 。

自1985 年佐匹克隆开始应用于临床起，其滥用和成瘾倾向一直是争论的话题。一些研究指出其风险性低或很小[6-10] 。但同时，在不同的国家，有越来越多的滥用、成瘾和戒断并发症的个案报道[10-14] 。一个应用美国联机医学文献分析和检索系统，就1966~2002年的资料进行系统性的回顾研究[15]发现，共有2例被确诊为佐匹克隆滥用或成瘾的病例。然而，在所有的病例报告中病例数目很小，最大的数目是6例[16]，而且没有足够的资料去具体分析佐匹克隆滥用者的特征。

屯门物质滥用诊疗所是香港医院管理局辖下6间物质滥用诊疗所中的一个，成立于1995 年9月，为约10万的人口提供服务，服务包括门诊和住院戒毒，治疗相关的精神及心理疾病，所有病人都是由其他医生或社工转介并自愿接受治疗的。近年来，似乎越来越多的佐匹克隆滥用者到屯门物质滥用诊疗所寻求治疗。这个回顾性研究的目的在于，探讨过去9年在我们诊疗所就诊病例中佐匹克隆滥用的普遍程度及其成瘾倾向。



实 验

1对象和方法

1.1对象

自1 995 年 9月一2004年9月，到屯门物质滥用诊疗所登记就诊的872例滥用者。



1.2方法

首先使用电脑医疗记录 (只记录滥用药物的种类) 进行初步搜索，寻找佐匹克隆的滥用个案。通过复查所有佐匹克隆滥用者的手写医疗记录，获取他们的基本特点资料，这包括人口统计学资料 (年龄、性别、婚姻状况，受教育程度、就业状况、犯罪记录)、伴发精神病 (不包括药物导致的精神病) 和多种药物滥用 (在过去的一年中，活跃地滥用3种或以上的药物)，初诊时滥用佐匹克隆的临床资料 (滥用或成瘾的诊断、滥用的持续时间、曾经滥用的每天最大剂量、在过去一年中滥用的频率和常用的剂量、开始滥用的原因、不良反应和戒断症状) 及其治疗结果 (在屯门物质滥用诊疗所治疗的持续时间，最终滥用佐匹克隆的情况)，以直至2004年9月或终止服务时的状况为准。

诊断佐匹克隆成瘾以DSM-Ⅳ为标准。然而，对于佐匹克隆滥用的诊断，则用世界卫生组织的较为广泛的标准 (持续或间断地过分使用，与合理的医疗用途无关或相矛盾)，因为某些滥用药物者可能不具备在DSM-Ⅳ中列出的有关有临床意义上的功能损害的情况。



2 结果

2.1佐匹克隆滥用者的数目

在 872个登记病例中，87例在初诊时的过去l a中有佐匹克隆滥用史。每年的病例数如表1所示，近4 a佐匹克隆滥用者的比例剧增，到2004年9月前，增至占该年新病例24.5%。



】
2.2佐匹克隆滥用者的基本特点

详细的数字如表2所示。在所有的87例滥用者中，性别的分布大致相等 (39例男性和48例女性)，平均年龄是35 a;约80%的受教育水平为初中或以下；约60%失业；50%有犯罪记录和57%有伴发精神病。


2.3佐匹克隆滥用者的药物滥用基本特点

详细的数字如表3所示。在所有的87例滥用者中，62.1%是成瘾的。滥用的情祝相当严重，持续滥用的时间长达204个月，曾用最大剂量高达200片·d-1，69.0%每天都滥用。在开始滥用佐匹克隆的原因中，失眠是最普遍的，达82.8%。65.5%的病例出现不良反应，最常见的症状包括记忆力受损(46.0%)，激动(24.1%)和日间昏睡(14.9%)。63.2%的病例出现戒断症状，失眠(46.0%)、易怒(25.3%)和焦虑(23.0%)是三个最常见的戒断症状。在2004年9月或终止服务时的最终状态方面，只有37.9%的病例能成功地保持断药状态

兴奋剂类分析方法系列讲座（14）（下）香港医院提醒新毒品－佐匹克隆的滥用和成瘾倾向

3讨论

3.1局限性

由于这是药物滥用者的回顾性研究，会带来一些本质上和固有的局限性。首先，在我们服务的10万人口的区域中只有一间物质滥用诊疗所，来自我们诊疗所的病例不可避免地受到“转介筛选偏见”的影响；同时，样本似乎仅代表了最严重的病例。此外，病人本身的回忆偏差和医疗记录资料偏差也是回顾性研究普遍存在的问题。



3.2佐匹克隆滥用非罕见

根据香港药物滥用资料中央档案室的第53份报告[17] (香港政府对所有的自愿呈报的药物滥用病例进行收集和分析)，自1994到2003年，没有佐匹克隆滥用者的病例报告。然而，我们的资料却显示在1995-2004，至少有87例活跃的滥用者。虽然，确切的佐匹克隆滥用者的数目很小，但2004年在屯门物质滥用诊疗所收治的新病例中24.5%有该药的滥用史。

在Hajak’s的文章中[15]，虽然只有22例佐匹克隆滥用的确诊报告，他提出在临床实践中可能有许多的病例没有报告，他引用挪威国家法医毒物学学院的报告[18]，指出在1994年一1999年间，从怀疑吸毒的司机的血液检验中发现，有101例含有佐匹克隆，当中有60%其佐匹克隆的浓度超过了正常口服治疗剂量后应有的浓度。

根据屯门物质滥用诊疗所的资料和以上来自挪威的报告，佐匹克隆滥用的情况确实要比文献中报道的要多。虽然，这87例的研究报告是目前为止最大数目的研究报告，但它只代表这个问题的冰山一角。因此，在药物滥用领域的从业人员和医疗工作者应对该药的滥用倾向有更高的警觉性。



3.3长期使用佐匹克隆有害和成瘾

本研究的病例滥用的持续时间、频率和滥用的剂量是令人震惊的，如此长期和严重的滥用，一般认为，这些滥用者会经历更多的不良反应，特别是远期的，事实上其中40个病例(46%)投诉有某种程度上的记忆力受损。在英国有报道说几个佐匹克隆的滥用者有严重的记忆缺失[19] 和一例持续服用佐匹克隆(15rng·d-1) 2 a后出现记忆缺失综合症的报告[20]。因此，对长期和大剂量的滥用者进行认知功能检查很重要。

有 54 例被确诊为佐匹克隆成瘾，难怪有5例在停用佐匹克隆时曾经有戒断症状。失眠(46.0%)、易怒 (25.3%) 和焦虑 (23.0%) 是三个最常见的戒断症状。值得注意的是，有2例在停药阶段出现惊厥。先前曾有一例停药抽搐的报道[11]。



3.4佐匹克隆的滥用倾向可能不比苯二氮卓类低

有人估计，有1/3的苯二氮草类长期使用者会对其产生身体依赖[7] 。从所获得的以前的资料判断 (至2002年只有22例的报道)，佐匹克隆滥用或成瘾的倾向确实比苯二氮卓类要低很多。但此研究显示，撇开研究的局限性，佐匹克隆的滥用和成瘾的流行情况并不相先前估计的那么低。新近的一个关于“使用扎勒扑龙，唑吡坦和佐匹克隆进行失眠短期治疗”的指南[21] 强调，这一类Z一药应该只开短期处方，并且一个疗程的治疗不应超过4周。此

外，通过对可获得的研究资料对Z一药与苯二氮卓类药比较后，该指南推断，两类药物在宿醉效应方面没有肯定的差异，并且没有资料证明两类药物在戒断症状或成瘾的频率上有所分别。同样地，本研究显示，在长期使用后，大部分病例经历有戒断症状。



4总结

佐匹克隆的滥用或成瘾倾向的程度仍未完全清楚，但此研究显示，佐匹克隆的滥用和成瘾的流行情况并不相先前估计的那么低，约10%的本诊疗所就诊病例中在过去一年曾滥用此药而近年更有上升趋势，而且54例被确诊为佐匹克隆成瘾，因此，小心地使用该药是一种谨慎的表现，以避免重蹈由于曾一度被认为是低滥用或成瘾倾向的、安全的苯二氮草类药物而导致滥用和医源性成瘾的历史覆辙。这一警告被发表在《针刺》的社论上，题目是“佐匹克隆：在镇静剂列车上的一节车箱”，其评论说:“尽管镇静剂列车偶尔停下来，但至今登上列车的人仍然很多，下车的人却很少”[22]

兴奋剂类分析方法系列讲座（15）-甾体类兴奋剂-尿中睾酮的HPLC分析 
 
HPLC测定甾体类兴奋剂—

尿中睾酮／表睾酮比的方法学研究



摘 要  本文建立了一种用HPLC测定尿中睾酮／袁睾酮浓度比(T／ET)的方法。采用C18色谱柱，流动相为甲醇一水(68:32  V／V)，紫外检测波长242nm。在尿液净化步骤中使用国产C18填料的自制小柱进行液一固提取，并在淋洗过程中增加了酸、碱淋洗，获得了满意的净化效果。本方法操作简单，费用低，测得的姑果与GC—MS检测结果相一致。



本文由江苏省体育科学研究所的丁宁炜和姜文凯俩位研究人员为本所建所20周年纪念《体育与科学》专刊上发表的论文，现全文介绍如下



前 言

高效液相色谱 (HPLC) 与常规用于兴奋剂检测的GC—MS方法相比具有样品预处理较简单，检测费用低的特点。适合于基层单位初检使用。目前已有HPLC用于某些甾体类兴奋剂检测的报导. ，但有关HPLC方法用于测定甾体类兴奋剂中睾酮的报导尚未见到(指写文章时)。睾酮是内源性激素，其体内浓度随个体不同而差异很大，因此无法以绝对定量来作为阳性判定标准。而需要用睾酮与表睾酮的浓度比作为判定指标。表睾酮是体内激素代谢过程中产生的一种与睾酮互为差向异构的甾体物质，在正常情况下尿中睾酮与表睾酮的浓度比约为1／1，而服用睾酮者该比值将明显升高，按照国际奥委会医学委员会制定的标准，尿液中两者浓度：睾酮／表睾酮≥6／1者判定为阳性。本文用HPLC方法对睾酮服用者的尿液检测进行了较为系统的研究。建立了一种能较准确反映尿中睾酮/表睾酮浓度比的检测方法。



实 验

1 材料与方法

1．1 仪器与试剂

高教液相色谱仪Waters 625系统，紫外一可见光检测器Water 486，积分仪Water 743(美国Waters公司)；柱温箱(常州自动化仪表厂)。固相提取所用自填预处理小柱填料为KYWG—C18，颗粒度10~30μ(天津化学试剂二厂)；小柱预处理支架、真空泵、柱管及微孔聚四氟乙烯垫(天津腾达过滤器件厂)。睾酮(testosterone)，表睾酮(epitestosterone)标准品，β一葡萄糖醛酸甙水解酶(β—glucurorfidase)(美国Sigma公司)；甲醇(HPLC级、淮阴精细化工研究所)；水为二次重蒸馏水。



1．2 色谱条件

色谱柱200×4.6mm；固定相：ALLTECH C18，5μm， (淮阴精细化工研究所组装) 流动相：甲醇一水(68：32)；流速lmL／min； 检测器波长242nm，衰减：0.005 AUFS；柱温：300℃。在此条件下睾酮与表睾酮以及内标(去氢甲基睾丸素)可得到良好分离，见图一




1．3 尿样水解和预处理

于10mL干净离心试管中加入待测尿样5ml，加入PH 5.15，lmol/L NaAC—HAC缓冲液lml，加人β一葡萄糖醛酸甙水解酶10000单位，加入内标溶液200μL (浓度为lng/μL的去氢甲基睾丸素甲醇溶液)一混匀后置于370℃水浴中温育20小时后取出，4000转／分，离心15分钟取上清液于自填预处理C18小柱．负压抽提(小柱已先活化)一2mL双蒸水淋洗二次一T血缓冲液(PH8．25，0．05tool／L)lml淋洗→2ml双蒸水淋洗二次→NaAC—HAC缓冲液 (PH 3.91，0.05mol／L) lml淋洗→2ml双蒸水淋洗二次→30％甲醇水溶液lml淋洗→100％甲醇lml洗脱，洗脱液由干净试管收集，于500℃下空气吹干→200μ1流动相溶解后，取20 μ1进样分析。



1．4 标准曲线

精确称取睾酮和表睾酮标准品80mg，用甲醇溶于100ml容量瓶制成储备液，然后用甲醇稀释成浓度为40ng/μ1的睾酮和表睾酮标准溶液。分别在5份5ml的空白尿样中依次加入上述标准液5，10，20，40，80 ，并在每份试管中加入内标(浓度为lng/μl的去氢甲基睾丸素甲醇溶液)200μl。按上述尿样预处理方法以及色谱条件进行HPLC分析，以睾酮和表睾酮与内标峰高比(Hr)对睾酮和表睾酮浓度(C)作图，得到标准曲线分别如图二、图三所示。并计算得到回归方程如下：


1、5 回收率

用上述同样方法将标准液放入6份空白尿样中，经预处理后进样测得的睾酮和表睾酮

的峰高与同浓度未经处理的对照品的峰高之比即为回收率。平均回收率结果如下：

睾酮：  71．78±6．45％  CV=8．986％

表睾酮：70．96±5．73%  CV=7、6％



1．6 精密度试验

分别配制睾酮和表睾酮浓度为80ng／ml和640ng／ml的尿液样本7份， 同日处理进样测定日内误差。连续5天处理进样测定日间误差 结果见下表


1．7 线性范围和检测限

本方法睾酮和表睾酮尿浓度在40ng／ml至640ng／ml范围内浓度与峰高比呈良好线性

关系。最低检测限为8ng。



2 结果

2．1 用本文方法测定两名受试者使用睾酮后尿中睾酮／表睾酮浓度比的变化趋势，结果显

示用药后该比值迅速升高，并超过6：1，于10至24小时达高峰。用药前和用药后色谱

图分别如图1(b)和(c)所示。



2．2 尿样检测结果及其与GC—MS测定结果的比较：

健康志愿受试者6名，采用随机给药，其中3人给予睾酮。于34小时后收取尿样，并分装为两份，一份以本文HPLC方法测定，另一份用GC—MS方法测定。数据显示两种方法结果相一致，用药者尿样均呈阳性，而未用药者呈阴性。两种方法测定结果(T／ET)见表-3



3 讨论

睾酮属人体内源性甾体激素。表睾酮是体内代谢过程中产生的一种与睾酮互为差向异

构体的物质。二者在结构上的差别仅仅是17位羟基的构相不同。睾酮为17位β羟基，表

睾酮为17位α羟基。其结构式如下：



经光谱扫描确定睾酮及表睾酮的紫外检测渡长为242nm，曾试用将被测物进行2，4二硝基苯肼衍生，正相色谱紫外检测，结果显示杂质增多，效果不佳，固未采用。

尿液中成分复杂，在HPLC测定之前使用有效方法使尿液净化的过程显得由为重要，要求通过该步骤尽量去除干扰测定的杂质成分，同时浓缩被测组分。通常使用的有液相提取法和固相提取法，根据实验摸索，发现固相提取法净化尿液效果较好，回收率较高，操作方便，因此决定选用固相提取法。在使用液一固提取的实验中分别观察了XAD一2中性树脂柱(100目)，成品Sep—Pak C18小柱[3] 和用国产C18填料(颗粒度10~30μ ，天津化学试剂二厂) 自填小柱的处理效果。结果表明：XAD一2中性树脂柱处理的尿样中组分丢失较多。成品小柱处理效果较佳。但其价格高， 尚无条件大批量使用。自填小柱在开始试用时，由于对填料装填量和装填松紧度掌握得不好， 因此在负压抽提过程中常发生堵塞。后经过反复多次操作，取得了经验，能较好控制装填量和松紧度，使自填小柱的处理效果接近成品小柱。由于其价格低廉，在后来批量实验中均使用自填小柱。在固相提取法中淋洗也较关键，要求在这一过程中尽可能多地洗脱吸附在小柱上的杂质，而同时保留被测组分。首先按传统常用的方法依次用双蒸水，30％ 一50％甲醇水溶液淋洗，最后以纯甲醇洗脱。但用该方法处理的样品进样检测后发现被测组分周围杂质峰干扰十分严重。因此，必须设法改进淋洗方法，提高进样液净化程度。由睾酮和表睾酮为中性甾体物质而考虑到可分别用酸性和碱性溶液淋洗小柱，先后将其中的碱性和酸性杂质中和成盐，随后用水洗脱。经此方法处理后，净化效果明显，色谱图中杂质峰大大减少。

从本方法与GC—MS方法的结果比较可以发现两种方法在判定睾酮／表睾酮浓度比大于或小于6／1方面呈一致，因此本方法可以满足对睾酮初检的需要。且适用于普通条件的实验室，能较方便地对训练中的运动员随时进行抽查。

致谢：山东省体育科学研究所孙挂芳老师在GC—MS测定方面的大力帮助。

兴奋剂类分析方法系列讲座（16)液-液-液微萃取HPLC测人血中局部麻醉剂 

液-液-液微萃取-高效液相色谱法测定

人血浆中的局部麻醉剂



摘 要  建立了液-液-液微萃取与高效液相色谱联用技术同时测定人血浆中3种局部麻醉剂利多卡因、布比卡因和丁卡因的方法。考察了萃取时间、料液pH值和搅拌速度的影响，取佳萃取条件是萃取溶剂为200μL苯，接受相为1.0μL  0.2 mol/L HC1，搅拌速度为250r/ min，萃取时间为45min。在该条件下，获得了高的富集因子(大于305倍)。方法的线性范围为:利多卡因和布比卡因0.025-- 5 mg/L，丁卡因0.05一5mg/L，相关系数大于0.996；检出限依次为0.005、0.015和0.025mg/L;相对标准偏差小于5%。该方法能有效地去除血浆中复杂基体的干扰，萃取效率高，有机溶剂消耗少，是一种有效、灵敏的同时测定血浆中利多卡因、布比卡因和丁卡因的方法。



本文是由教育部和湖南省部在湖南师范大学共建的重点实验室（化学生物学及中药分析）的张朝辉、康绍英、 陈波、 马铭、 姚守拙等几位老师们和长沙市第四医院的赵倩医生共同完成。局部麻醉剂的分析方法有很多种，但使用三液微萃取的前处理方法不多见，是一种值得参考的前处理方法，省时、省费可一气哈成，只是微量操作技巧方面要求高些。



1 前 言

利多卡因 、布比卡因和丁卡因是我国目前广泛应用的局部麻醉剂。近年来，临床上普遍将局部麻醉剂混合使用，以达到较好的协同麻醉效果[1]。局部麻醉剂的过量使用或滥用可能导致意外医疗事故。因此，在临床医学和法庭案例中，需要同时分析体液中多种局部麻醉剂的准确、灵敏、简单的分析方法。然而，由于体液组成复杂，且其中目标分析物的含量较低，因此，分析前常需要对体液中的目标分析物进行分离和富集。液-液萃取(LLE)[2~6]、固相萃取(SPE)[7,8] 和固相微萃取(SPME)[9~11] 已被成功地用于气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)分析体液中局部麻醉剂的前处理过程。然而LLE和SPE技术具有耗时和需要较大量有机溶剂的缺点；而且在SPME技术中，每次样品解吸附后，都需要对纤维进行处理，以消除溶剂和样品残留带来的影响。

近年来 ，液-液-液三相微萃取技术(LLLME)作为一种新的样品前处理方法得到了迅速发展〔[12,13]〕。LLLME因其较高的萃取效率，很强的抗干扰能力，可有效去除样品基质中的复杂成分，已与HPLC联用用于环境污水等复杂样品的前处理过程[14,15] Lee等[16] 用两步液-液-液微萃取与HPLC联用检测了废水中的消炎药物，获得了很高的富集因子。但其操作较复杂，需进行两次微萃取。本实验采用一次液-液-液三相微萃取技术处理血浆样品，不仅可以消除血浆中共存组分的干扰，而且对血浆中的局麻药进行了富集，利用液相色谱方便、准确的对血浆中的利多卡因、布比卡因和丁卡因进行了同时检测，降低了它们的检出限，提高了方法的灵敏度。



2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1100液相色谱仪系列 (德国Agilent公司) ，由G1312A液相泵、G1316A柱温箱、G1315B二极管阵列检测器、7725手动进样阀和25μL微量进样器组成；HJ-2磁力加热搅拌器；PHS-3C 型酸度计。利多卡因 (湖南洞庭药业股份有限公司)、布比卡因 (上海禾丰制药有限公司) 均为盐酸盐注射液，丁卡因 (青海制药厂) 为盐酸盐粉末。乙腈为色谱纯，其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。含盐酸利多卡因、盐酸布比卡因和盐酸丁卡因的标准储备液及由其稀释而成的标准溶液均置于4℃冰箱中保存。健康人血浆从湖南中心血站购得(冰箱中一40℃冷冻保存不超过3星期)，含利多卡因、布比卡因和丁卡因的加样血浆于4℃冰箱中保存，保存时间不超过24 h。病人血样来自长沙市第四医院，病人首先被一次性注人布比卡因10.9 mg (腰麻)，然后在0.5 h 内分4次注人利多卡因，累计量为282.9 mg (硬膜外麻醉)，从实施麻醉开始计时，2h进行第一次采样，7h进行第二次采样。局部麻醉剂的标准溶液、加样血浆溶液及病人血浆溶液，以0.1 mol/L NaOH 溶液调节pH值至11,作为本实验的料液。



2.2 色谱条件

色谱柱 ：Spherigel C8:柱 (5μm,150mm×4 .6 mm  i .d. ) (大连江申分离科学技术公司)，流速为1.0 mL/min，检测波长为210nm，进样量为1μ L；流动相：750m L，0.02 5mol/L三乙胺水溶液，以磷酸调pH3 .0， 用0.45 μm滤膜过滤，与250m L乙睛混匀，脱气10min备用。



2.3 实验方法

液-液-液 微萃取体系含料液相、有机相和接受相3个液相(如图1)。在萃取瓶中加入一个微型搅拌磁子和1 mL,pH为11.0的料液，缓慢加人200μL苯，再用25μL微量进样器抽取1μL 0.2 mol/L的盐酸溶液，微量进样器固定在铁夹上，其针尖浸人到有机溶剂中，小心按下微量进样器的活塞，使反萃相在有机相中形成一个小液滴悬挂在针尖上。开启搅拌器，搅拌速度为250 r/min，萃取45 min后，将反萃相小心抽回进样器，直接进样到高效液相色谱体系中进行分析，以萃取结束后分析物在接受相中的浓度和萃取开始前分析物在料液相的初始浓度之比计算富集因子。




3  结果与讨论

3.1液-液-液微萃取条件的选择

3.1.1 搅拌速度对萃取富集因子的影响

搅拌速度是影响萃取效率的一个重要因素。提高搅拌速度可以减小扩散层的厚度，增加对流-扩散传质速度，促进传质过程，提高萃取效率。本实验考察了120,250和320 r/min 3个不同搅拌速度对所研究的分析物的富集因子的影响，得到的富集因子分别为:利多卡因261.7,3 70.6 和399.8;布比卡因:189.1,305.2和323.6;丁卡因:223.6 ,345.2 和371.7。结果表明，富集因子随搅拌速度的增加而增大。但当搅拌速度增加到一定程度时，接受相微滴变得很不稳定。在保证液滴稳定的前提下，搅拌速度选择250 r/min。

3.1.2 萃取时间对萃取富集因子的影响

在其它萃取条件保持不变的情况下，研究了萃取时间(5~60 min)对3种麻醉剂的富集因子的影响，结果见图2。由图2可知，富集因子随着萃取时间的延长不断增大。但进一步延长萃取时间，会使少量的接受相溶解在有机溶剂中。考虑到萃取时间的选择既要保证较高的灵敏度又要节约时间，故将萃取时间定为45 min 。

兴奋剂类分析方法系列讲座（16)（下）液-液-液微萃取HPLC测人血中局部麻醉剂

3.1.3 pH值对萃取富集因子的影响

液-液-液微萃取中，样品溶液的pH值对萃取过程中的传质起着至关重要的作用。萃取前，通过加人NaOH溶液调节料液相的pH值至11，使目标麻醉剂去离子化以降低其在料液相中的溶解度。由于接受相的强酸性，麻醉剂的中性分子在有机相与接受相的界面上再次被离子化，进而被反萃进接受相。由于3种麻醉剂均呈弱碱性且具有相似的pK值(其pKa值依次为7.9，8.1 和8.5)，本实验考察了pH值在8~14范围内料液相pH值对萃取的影响，结果如图3所示。在料液相pH值为8~10范围时，分析物的富集因子随pH值的增加急剧增加。但是当料液相pH值高于10时，发现分析物的富集因子没有明显的增加；而且，当pH值高于12时，丁卡因可能由于醋键水解，使得其富集因子急剧下降，综合考虑，选择料液相pH值为11。



3.2 方法的线性范围、检出限和精密度

准确吸取健康人血浆0.5m L，分别加人3种局麻药的标准混合溶液，稀释至1m L，使血药浓度相当于0.025，0.05 ，0.1，0.2，0.5，1.0，2.5及5 mg/L。用0. 1 mol/L的NaOH溶液调节料液pH值为11，在优化的实验条件下萃取45 min，进行液相色谱检测。利用色谱峰面积对样品浓度进行线性回归，得到利多卡因、布比卡因和丁卡因3种麻醉剂的线性回归方程分别为：y= 0.184X+0.011，y= 0.883X一0.002和y= 0.447X一0.011；相关系数分别为：0.999，0.9% 和0.997；线性范围分别为：0.025~5，0.025~5和0.05 ~5mg/L；检出限分别为:0.005，0.015和0.025mg/L。以加样血浆浓度为0.5和5 mg/L的两个样品考察了方法的精密度和回收率(见表1)。



研究表明，色谱峰面积在所考察的浓度范围内与浓度呈良好的线性关系，方法的精密度高，回收率介于96.0%~106.3%之间。说明该方法用于血浆中局麻药的测定，能获得准确的结果。



3.3 实际血样的检测

标准混合溶液的色谱图和加样血浆经过液-液-液微萃取后的色谱图分别见图4(A)和图4(B)。由图4(A)和图4(B)可知，局麻药通过LLLME后得到了很大程度的富集。



以此为依据，本实验在优化条件下，对实际病人的血样进行了测定，图4(C)和图4(D)分别是实施利多卡因、布比卡因麻醉7h时的病人血浆直接进样的色谱图和其LLLME色谱图。由图4(C)可知，由于病人血样复杂，且局麻药的浓度较低，无法直接进行测定。比较图4(D)和图4(C)可知，LLLME可以消除血浆本身对局麻药检测的干扰，且局麻药的浓度经微萃取后得到了明显富集。测得2h后所采血样中的利多卡因浓度为1.06 mg/L,布比卡因浓度为0.22m g/L；7h 后所采血样中的利多卡因浓度为0.28 mg/L，布比卡因浓度为0.06mg/L。

说明该LLLME-HPLC方法消除干扰能力强，灵敏度高，可以用于实际血浆样品中局麻药的测定。

兴奋剂类分析方法系列讲座（17）-GC和GC/MS推断毒品来源

GC和GC/MS技术在毒品来源推断中的应用



摘 要  目的应用气相色谱(GC) 和气相色谱/质谱联用(GC/MS)技术，定性、定量分析毒品案例，推断毒品来源。方法采用GC/MS法定性分析毒品样品中的主成分、痕量杂质、掺假剂和稀释剂，并选择GC-FID和外标法定量分析上述各组分，通过定性和定量数据的统计比对，并用SPSS1 0.0 数据统计分析软件对分组结果进行验证，推断毒品样品之间来源的区别与联系。结果用GC/MS定性分析、GC-FID定量分析和SPSS1 0.0 数据统计分析软件将12个案件的毒品按来源分成7组，其中1、6、7、11号样品和l0A、10B样品分成两组，2、3、5、9号样品各成一组，4号和8号样品分成一组。上述12起案件的毒品来源分析和比对结果，经送检部门反馈的破案信息证明，与案件的真实情况十分吻合。结论应用GC/MS，GC-FID技术分析毒品，可准确推断毒品来源。



本文是国家十五科技攻关项目基金，由朱 军 1,2 ，赵 敬 真 2， 于忠 山 2， 王 俭1,3，刘 耀2（1.西安交通大学医学院；2.公安部物证鉴定中心； 3.公安部科技局) 共同完成，



前 言

毒品来源推断，主要是对毒品样品进行全面的理化检验及组成分析，建立毒品样品的指纹图，并采用系统科学的统计和比较方法处理数据，通过比较样品之间的相似程度，来推测毒品可能的产地、相关的加工工艺和运输过程等毒品来源信息[1]。目前，对毒品各种来源信息进行全面分析并准确推断其来源的报道甚少。本文作者采用GC和GC/MS技术，对12起毒品案件的样品进行定性、定量分析，找出这批毒品样品之间的区别、关联和相似性，以获得相关的毒品情报信息，为打击毒品犯罪服务。



实 验

1 仪器与试剂

仪器  VarianC P-3800型气相色谱仪 FID检测器 (Varian公司，美国)，HP一1弹性石英毛细管柱30m× 0 .32 mm×0 .25 μm ( H P公司，美国)；VarianSaturn 2000 GC/MS/MS联用仪 (Varian公司，美国)，HP一5MS弹性石英毛细管柱30m×0 .32 mm ×0 .25μm (HP公司，美国)。

样品  1 2起案件的待检毒品，编号为(2003)4888 -4899;对照用的MDMA (3 ,4-亚甲基二氧基甲基苯丙胺),MDA(3,4-亚甲基二氧基苯丙胺)、甲基苯丙胺和咖啡因等各种毒品标准样品购自国家麻醉药品实验室。

试剂  甲醇(色谱纯，JT Baker公司，美国)。



2 方法与条件

定量定性分析  准确称取毒品一定量，用甲醇溶解、振荡、离心、精确定容后，用GC/FID仪器和外标法定量，GC/MS仪定性。GC条件：柱温，140℃ (1min) 以10℃/ min升至280℃ ( 15min)；进样口及检测器温度，280℃ /280℃；载气，高纯氮，柱前压0.11MPa ( 15 PSI)；分流比，30：1。 GC/MS条件：柱温，100℃ (2min) 以30℃/min升至280℃ (17 min );进样口和传输线温度，280℃ / 250℃；载气，高纯He，恒流lm l/ min；分流比，20：1； 质谱数据采集模式，全扫描；溶剂延迟时间，3 min；倍增器电压，1.2kV。

数据统计分析  采用数据统计分析软件SPSS10.0中的分层聚类分析方法(Hierarchical ClusterAnalysis HCA )处理毒品样品的定性、定量分析结果，并分组比对。毒品 来 源 推断根据毒品样品中主成分、痕量杂质、掺假剂和稀释剂的GC和GC/MS定性、定量结果，并结合待检毒品的外观特征等因素，采用系统科学的统计和比较方法处理数据。通过比较样品之间的差别和相似程度，分析每个案件之间毒品来源的内在区别与联系。



3 结果与讨论

12 起毒品案件中的待检毒品的外观特征，以及定性定量分析比对结果见表-1




根据 表 1结果分析：

(1) 1、6、7、11号样品虽然外观形态不尽相同，但其所含毒品成分(MDMA) 和添加剂成分 (咖啡因) 相同，且含量非常接近。据此推断，4个样品可能来自同一加工厂或具有相同的来源地，其中1号和7号样品可能是同一厂家的同一批次产品。

(2) 2号样品为结晶体，所含毒品成分(甲基苯丙胺)单一，且含量达77.75%，推断其产地应具有很好的生产工艺和提纯技术。

(3) 3号样品含有甲基苯丙胺、MDA和MDMA等3种毒品成分，组成与其它样品都不相同，推断其可能具有不同的特殊来源。

(4) 4、8、9号样品虽然外观极其相似，所含毒品成分(氯胺酮)相同，但9号样品中的添加剂不同于4号和8号样品，据此推断3个样品有着紧密的联系，9号样品和4、8号样品可能来自同一加工厂或具有相同的来源地，但属于不同的生产加工批次。

(5) 5号样不含毒品成分。

(6) 10A和I0B样品虽然具有不同的外观形态，但所含毒品成分(MDMA)相同。推断其可能来自同一个加工厂或具有相同来源的不同批次。

上述结果 ，采用数据统计分析软件SPSS1 0.0中的HCA法进行分析，并对分组结果进行考察和验证，结果见图-1 



由图 1可 见，6、11、7、1号样品和10A、10 B样品虽自成一组，但两组位置相邻；3、9、5、2号样品各自成一组。4号和8号样品虽成一组，但相邻9号样品。聚类分析分组结果与上述人工推断完全一致。




图 2,3 示 例GC/MS法和GC/FID法定性、定量分析毒品样品的总离子流色谱图和GC/FID色谱图。

分析结果表明： 1号案件的毒品是摇头丸，其中MDMA含量为60.21%，添加剂为咖啡因，其含量为5.20%。上述 12起 案件的毒品来源分析和比对结果，经送检部门反馈的破案证明，与案件的真实情况十分吻合，分析结果准确、科学的揭示了每个案件之间毒品来源内在

的区别与联系，为禁毒部门提供了所需的情报和信息。

SPSS是目前世界上最优秀的统计分析软件之一，被广泛用于化学、经济学、生物学、农业等各个领域，为计算机完成数据处理和分析任务提供了强有力的支持[2]。本文案例应用表明：SPSS在大批量分析处理毒品来源信息和数据方面具有很好的应用价值。

兴奋剂类分析方法系列讲座（18）-毛细管区带电泳在海洛因毒品分析及其来源推断中的研究 
 
毛细管区带电泳在海洛因毒品分析及其来源推断中的研究



前 言

海洛因是目前最为流行而且对人类危害最大的毒品之一，海洛因即二乙酰吗啡，是由吗啡衍生而来的一种半合成品，吗啡则从罂粟植物中提炼，因为罂粟种植和生产工序不同，海洛因毒品的成分非常复杂，所含罂粟碱的种类、含量以及乙酰化衍生物各不相同，而在毒品交易、转运过程中各种赋形剂、增效剂和掺假物的加人更增加其复杂性，一般海洛因毒品中可能出现的具有代表性的成分有：二乙酰吗啡、O6单乙酰吗啡、O3单乙酰吗啡、乙酰可待因、那可汀、罂粟碱等，常见的掺假物有普鲁卡因药物、咖啡因、巴比妥类药物等，其它毒品或药品成分也可能以不同比例被加人到海洛因毒品中。

海洛因毒品成分的复杂性在给毒品分析提出挑战的同时，也为毒品的来源推断提供了依据，我们可以通过仪器分析对海洛因毒品中的主要成分、次要成分、稀释剂和掺假物进行精确的定性定量，取得毒品样品的指纹图谱，从而进一步对比不同来源、产地海洛因毒品的标准指纹图谱库，来进行海洛因毒品的来源推断。来源推断的关键是建立标准的分析方法，对海洛因毒品中的各种代表成分进行全面、准确的分析。毛细管区带电泳(CZE)由于其高效、快速、微量的特点，可以用来对海洛因毒品成分的精确定性定量分析，可用来建立毒品样品的指纹图谱。我们通过毛细管区带电泳模式，成功地实现了对海洛因、吗啡、O3单乙酰吗啡、O6单乙酰吗啡、罂粟碱、可待因、蒂巴因、那可汀、乙酰可待因和苯丙胺、甲基苯丙胺、麻黄碱等掺假剂同时分离.



    本文是国家“十五”科技攻关基金资助项目，由温涛1，王义明1，罗国安1，赵盆2.3，王俭2.3 (1清华大学化学系；2.公安部物证鉴定中心；3.中国人民公安大学) 等教授和研究人员协作初步实验结果，是一种新手段-毛细管区带电泳模式测毒品来源，值得参考，可惜没见到对毒品来源的分析图。



实 验

1 实验仪器及样品

Agilent 3DCE毛细管电泳仪，毛细管：50μm×6 0c m (有效长度50c m) 未涂层石英毛细管柱.

分离对象为O3单乙酰吗啡、O6单乙酰吗啡、吗啡、盐酸罂粟碱、磷酸可待因、蒂巴因、那可汀、乙酰可待因和盐酸海洛因九种吗啡类毒品，以及苯丙胺、甲基苯丙胺和麻黄碱毒品添加剂，所有毒品样品标准品均由公安部物证鉴定中心提供.



2 结果及讨论

选用磷酸盐缓冲液体系，考察了pH值 (2.5 、3.5 、4.5 、5.5) ，缓冲液浓度 (40 mmol/L、60 mmol/L、80 mmol/L、100 mmol/L) 以及缓冲液中有机溶剂 (甲醇) 的比例(10%、15%、20%、25%) 等因素的影响在分离电压为25 kV下，发现：



2.1  所有吗啡类物质和苯丙胺类添加剂在最优条件下能达到基线分离，O3单乙酰吗啡、O6单乙酰吗啡、吗啡、盐酸罂栗碱、磷酸可待因、蒂巴因、那可汀、乙酰可待因和盐酸海洛因的出峰时间在17~20 min范围内；苯丙胺、甲基苯丙胺和麻黄碱得到基线分离，出峰时间在10~12 min范围内.



2.2 随pH值的降低，分离时间变短，2.5-3.5间分离效果稳定且为最好。



2.3 相对最优条件为：pH值3.5，磷酸盐离子强度80 mmol/L，甲醇比例20%。



3 结论

毛细管区带电泳模式成功地实现了对海洛因、吗啡、03单乙酰吗啡、06单乙酰吗啡、罂粟碱、可待因、蒂巴因、那可汀、乙酰可待因和苯丙胺、甲基苯丙胺、麻黄碱等掺假剂地同时分离，可以通过毛细管区带电泳对各种物质的定性定量来进行海洛因的来源推断分析

兴奋剂类分析方法系列讲座（19）GC-MS分析尿中氯胺酮及代谢物 

尿液中氯胺酮及其代谢物的气相-质谱分析



摘 要  目的：建立尿液样品中氯胺酮及其代谢物去甲氯胺酮、去氢去甲氯胺酮、脱氢去甲去氨氯胺酮的快速提取及气相-质谱（GC－MS）分析方法。

方法：尿液用10％碳酸钠调节pH＝9～10，乙醚液液萃取，GC－MS分析。

结果：该方法可快速检测氯胺酮滥用者尿液中的氯胺酮原体及三个代谢物，同时检测包括苯丙胺类药物在内的其它药物。

结论：该方法可快速进行氯胺酮滥用者尿液的分析。



前 言

氯胺酮（ketamine，K）是苯环己哌啶（N-1-phenycyclohexy-piperidine，PCP）的衍生物，属N-甲基-D-天门冬氨酸 （N－methyl-D-aspartate，NMDΛ）受体拮抗剂，临床手术用麻醉剂[1]。氯胺酮摄取后70％～90％在肝脏内经脱甲基、脱氨基、羟化等酶的作用进行代谢，最终转化成苯环己酮，其中有药理意义的两个代谢产物为去甲氯胺酮（Nor－ketamine，NK）、去氢去甲氯胺酮（Dehydronorketamine，DHNK），72小时内从尿中排出的药物中有2.3％的原体药物，1.6％的NK，16.2％的DHNK [2] 。DHNK去氨基生成脱氢去甲去氨氯胺酮（Dehydrodeamino-norketamine，DHDANK）。



目前国内氯胺酮的分析报道文献主要集中于血液中氯胺酮及其对映体的分析 [3-4]，尿液中氯胺酮及其代谢物的分析仅见两篇文献报道 [5-6]，本文通过对尿液中的氯胺酮及其代谢产物的检测，建立了服药24小时内收集的尿液样品中氯胺酮及其三个代谢物NK、DHNK、DHDANK的气相一质谱（GC－MS）检测方法，简便，快速，准确。



本文用GC-MS分析尿中氯胺酮（也称为K粉），由昆明市公安局五华分局刑侦大队从事法医毒物分析的文云波副主任法医师研究完成，对从事毒品和麻醉药品分析的人员有一定参考性，现全文介绍如下。



实 验

1 材料与方法

1．1 材料

实验仪器：HP5972A气相色谱质谱联用仪，El源 HP-5MS低流失柱，30m×0.25mm×0.25 μm（安捷伦）；Ormingant氮吹仪（美国）；涡旋振荡器（江苏太仓）。

试剂：氯胺酮标样（购自公安部物证鉴定中心）；去甲氯胺酮标样配成1 mg·ml-1甲醇液（购自美国Cerillant公司）；无水硫酸钠、碳酸钠、乙酸乙酯、乙醚均为分析纯(上海化学试剂公司)；高纯氦为99，999％（广州）；普氮为99，9％（昆明）。

样品：为随机取样的实际案件尿液样品，共13份。



1．2 方法

1，2．l 实验条件：柱温180℃（l min）30℃/min 300℃（l0 min）；进样口温度250℃：传输线温度280℃;；扫描速度2 scan／sec；不分流进样；柱头压5 psi。



1．2．2 提取：取尿液样品1 mL于离心试管中，碳酸钠l0％水液调节pH＝9～10，乙醚5 mL×2涡旋混合l min，3000 RPT／min离心2 min，合并有机相，无水硫酸钠脱水，40℃氮气挥干，40 μL乙酸乙酯溶解。



1．2．3  GC－MS分析：进样2μL进行GC－MS分析。

1．2．4  回收率测定：对Κ、NK进行回收率测定。分别添加1000 ng、500 ng、20 ng 的K、NK于l ml空白尿样中，采用上述方法进行提取，方法平均回收率为K 92％、NK 83％。



1．2．5  GC－MS检测限测定： 配制1μg·mL-1～l0ng·mL-1浓度的Κ、NK溶液，不分流进样，S／N≥3时Κ的检测限为3 ng，NK的检测限为3.6 ng。



2  结果

随机取实际案件样品13份尿样进行检测，结果如表1。色谱图、NK、DHNK、DHDANK质谱图见图1及图2。










3  讨论

方法除可提取出文献报道的DHNK、NK两种代谢产物外，还可提取第三种代谢产物脱氢去甲去氨氯胺酮，尿液杂质干扰少，DHNK、DHDANK、NK之间分离较好，适用于K滥用者尿液的分析；且每个样品提取、气相色谱质谱分析全过程仅用20分钟，适于快速确证分析。



方法可同时进行苯丙胺类药物及其它多种药物的分析，对分析滥用类型和滥用方式也是适用的。例如从1、6、8、10、11号样品中检出K的代谢物，同时还检出尼古丁的体内代谢物可铁宁，在7、8、12号样品中还检出苯丙胺类毒品、扑尔敏、邻甲苯海拉明，证明了多种药物混合滥用类型。



分析中发现相同提取量检出的代谢物种类、峰高及相对比例存在很大差异。如样品11中未检测到K、NK、DHNK；样品10中未检测到Κ、DHDANK，各样品中代谢物的含量从峰高看也存在较大差异，提示取样个体、样品采集时间与代谢物比例时间存在一定的关联，需大量样品分析统计数据得出更详细结论

兴奋剂类分析方法系列讲座（20）生物检材中苯丙胺类兴奋剂的$$lc-MS/MS分析 

生物检材中苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的$$lc-MS/MS分析



摘 要  目的：建立生物检材中苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的液相色谱-串联质谱( $$lc - MS/MS)分析方法。

方法：生物检材包括血液、尿液和毛发，采用稀释法和液-液提取的前处理方法，应用两个不同的液相柱，优化$$lc – MS/MS分析方法，并考察了血液和尿液基质的离子抑制作用。

结果：同时分析苯丙胺和MDA，液相1在3min内完成，液相2可用于确认分析或复杂基质分离。尿液稀释法检材用量少，前处理简便快速。毛发中苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的最低检测限(LOD)为0.005~0.05ng/mg。对送检案例检材产妇头发和胎毛进行苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的分析。

结论：本方法可用于生物检材中苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的同时分析，血、尿等生物检材的离子抑制作用是影响本方法灵敏度的主要原因。



    本文由司法部司法鉴定科学技术研究所的向平、卓先义、沈保华、马栋和沈敏与复旦大学上海医学院的姜宴等研究人员共同完成，是上海市自然科学基金项目的部分内容，文中的生物检材除血、尿还做了多项人体和胎儿毛发中含量的测定值得参考。现全文介绍如下。



前 言

    苯丙胺类兴奋剂是一类低分子量、合成的苯丙胺衍生物的统称，包括苯丙胺( amphetamine )、甲基苯丙胺(methamphetamine )、MDA(3，4-methylenedioxyamphetamine)和MDMA(3,4-methylenedioxymethamphetamine )，具有兴奋中枢神经和周围神经、抑制食欲、致幻等作用。苯丙胺类兴奋剂在舞厅等娱乐场所滥用非常严重，并存在与氯胺酮 (ketamine)混合使用。目前涉及苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的死亡案件不断上升，急需建立快速、简便、灵敏、准确地同时分析生物检材中的苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的方法。



液相色谱-串联质谱($$lc-MS/MS )是液相分离结合串联质谱检测的新型分析仪器，可直接分析难挥发性化合物、极性化合物、热不稳定化合物和大分子化合物，分析范围广，且不需衍生化步骤[1~3]。目前$$lc-MS/MS在我国较少用于毒物分析。本文研究建立$$lc-MS/MS同时定性定量分析生物检材(血液、尿液和毛发)中苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的方法。



实 验

1. 材料与方法

1.1材料

    氯胺酮、去甲氯胺酮、内标甲基苯丙胺-d5和氯胺酮-d4 ( Cerilliant公司)，甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA和麻黄碱等 (国家麻醉品实验室)，乙腈、甲酸和乙酸胺 ( Fluka公司)。API 4000三重四极串联质谱仪$$lc-MS/MS (Applied Biosystems公司)。

1.2  $$lc-MS/MS方法

1.2.1  液相1 

液相柱为Allure Ultra IBD ( Resteck公司) 50mm×2.1 mm × 5 μm，此前接phenomenex的保护柱。流动相为乙腈，缓冲液：20mM乙酸胺:0.1 %甲酸(80:20)，恒流200μ1/min 。

1.2.2  液相2 

液相柱为Allure PFP Propyl ( Resteck公司) 100mm×2..1 mm× 5μm，此前接phenomenex的保护柱。流动相为乙睛，缓冲液：20mM乙酸胺:0. 1%甲酸 (70: 30 )，恒流200μ1/min。

1.2.3  质谱 

采用电喷雾电离-正离子模式 (ESI+)，操作参数分别为：碰撞气 (Collision Gas ) 5；气帘气 (Curtain Gas ) 25；离子喷射电压 (Ionspray Voltage)4500 V；温度 (Temperature ) 450 ℃。每个化合物选取两个离子对，见表1。




1.3 样品前处理方法

1.3.1 尿液稀释法

20μl尿液加入1 ml流动相，混旋，离心，取5μ1进样。

1.3.2 血液、尿液提取法

血液或尿液1 ml加入2m1 pH9. 2磷酸缓冲液，加入3. 5ml乙醚，混旋，离心，取有机层，60℃水浴中挥干，加入100μ1流动相，取5μ1进样。

1.3.3 头发提取法

依次用0. 1%十二烷基磺酸钠、o. l%洗洁净、蒸馏水、丙酮洗涤，晾干后剪成约1mm长，备用。空白头发同法处理。头发20mg加0.1 mol HCl 1 ml浸泡过夜，取出后用1 mol NaOH调至中性，加2m1 pH9. 2磷酸缓冲液，以下同1.3.2项处理。

1.4 生物检材基质的离子抑制作用检验

    分别用液相流动相配制成1ng/ml和l0ng/ml的MDMA对照品稀释液，各取100μl×4份加至带衬管的液相进样瓶中。空白血液和尿液各1 ml × 8份，采用1.3.2步骤提取，挥干后，4份为一个浓度组，残余物中分别加入100 μ1配制的对照品稀释液溶解。各取5μ1进样。

2  结果与讨论

2.1结果与评价

    所建立的$$lc-MS/MS方法分离良好 (图1)，液相1在3 min内完成，与常规的GC/MS方法相比，大大节约了分析时间。液相2可用于确认分析或复杂基质分离。

    MS/MS可以进行两次离子选择作用，通常称之为多反应监测 (multiple reaction monitoring,MRM)，即通过MSl选择一定质量母离子，与气体碰撞断裂后，再经MS2选择一定质量的子离子，这样大大提高了分析的专一性和灵敏度，可以分析复杂基质体系中的待测物。本方法中每个化合物选取两个离子对，采用第一个离子对定量分析，以第二个离子对峰强度信噪比 (S/N) 大于3确定最低检测限(LOD)，增加了分析的准确性和特异性。

    尿液稀释法检材用量少，前处理简便快速。血液、尿液提取法经:过提取纯化，可减少离子抑制。

    本方法可同时分析苯丙胺和MDA，克服了气质联用仪（GC-MS）方法中由于分子量小、极性强而必须衍生化才能检测的缺点，且灵敏度比GC-MS [4] 高近100倍，同时加入甲基苯丙胺-d5和氯胺酮-d4作内标，定量分析准确 (表2)。



2. 2 生物检材基质的离子抑制作用

    基质的离子抑制作用是$$lc/MS-MS分析中存在的技术难题，是分析物信号损失主要原因之一，影响方法的灵敏度。参考Hendrickson [5] 的方法，本文以MDMA为目标物，采用血液和尿液为基质，观察基质的离子抑制作用。将对照品溶液进样的峰面积设为A，血液和尿液样品提取后加入相同量的对照品后进样的峰面积设为B，抑制作用(matrix  effect,  ME ) (%) = B/A×100%。结果见表3。



  由表3可看出，血、尿等生物检材的离子抑制作用是影响本方法灵敏度的主要原因，尿液样品高于血液，这可能是由于尿液中的无机盐离子成分相对较多引起。所以，在进行$$lc-MS/MS分析时，适当的生物检材前处理过程非常必要。

2. 3案例应用

    案例1  某公安分局送检头发样本，经去污处理、水解和提取后，GC-MS分析阴性。将提取残余物中加入流动相，采用$$lc-MS/MS分析，则检出甲基苯丙胺、氯胺酮和去甲氯胺酮。

    案例2  某妇女在怀孕期间一直滥用“摇头丸”，胎儿产下后有明显的烦躁不安等戒断症状。生产后的第2天紧贴根部剪取产妇头发和胎毛。产妇头发总长约15cm，从根部起按3cm分段分析，结果见表4



头发的生长速度大约为1~1.2cm/月[6]，由此表明，该产妇在怀孕期间一直滥用以MDMA和氯胺酮为主的兴奋剂。孕妇滥用药物不仅会影响胎儿生长，而且对胎儿今后的成长造成严重伤害。有报道从产妇和胎毛中同时检出尼古丁和吗啡类生物碱 [7,8]，同样，本案例胎毛中苯丙胺类兴奋剂和氯胺酮的浓度均小于产妇。所分析的头发段中未检出苯丙胺和MDA是因为药物进入毛发的程度与药物的亲脂性密切相关 [9]，苯丙胺和MDA的极性强所以很难进人头发。Stefanc Gentili [4] 在分析12份甲基苯丙胺阳性头发样品中，仅有1例检出苯丙胺；57份MDMA阳性头发样品中仅有1例检出MDA。

兴奋剂类分析方法系列讲座（21）《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》研究 

《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》研究



摘 要：体育运动中的兴奋剂问题是一个全球性的问题，需要各国政府、国际组织和非政府的体育组织之间进行合作。联合国教科文组织通过的《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》，几乎涵盖了有关兴奋剂的所有问题，对该公约的研究有助于兴奋剂的控制以及有关立法建设。



    本文由山东大学法学院的黄世席法学博士所撰写，他的研究方向是国际私法和体育法。此文是国家社会科学基金项目内容，为迎接第二十九届奥运，特选出介绍给网友们参考。



前 言

体育运动的发展以及过度商业化导致出现了越来越多的服用兴奋剂行为，为了保护体育运动的健康发展、运动员的权益以及体育伦理道德又必须对这种行为实行控制。服用兴奋剂的行为违背体育道德、医学道德，有悖于公平竞争的精神，并且与尊重运动员身体健康、构成奥林匹克运动基石的基本原则背道而驰，也践踏了由国际奥委会、国际单项体育联合会以及各国奥委会所颁布的竞技体育的法规［[1]。从总体上讲，在预防、教育、培训、提供信息以及反兴奋剂规定的协调和实施处罚措施方面，各国政府的作用是最基本的，但是也需要国际组织与各国政府的合作，因为兴奋剂问题已经发展成为一个全球性的问题。联合国及其下属组织——包括世界卫生组织、联合国国际麻醉品管制署、联合国教科文组织，连同各洲、各地区间的政府和非政府组织，都可以在它们各自领域做出应有的贡献。

具体到政府和非政府国际组织而言，在1989年9月16日签署了欧洲理事会《反兴奋剂公约》，2002年9月欧盟又在华沙通过了对该条约的附加议定书。1994年1月13日国际奥委会和其他体育组织通过的《洛桑宣言》同意应当同国家政府有关部门进行合作，国家机关和独立的体育组织有各自单独的但是又有互相合作的责任来消除体育运动中的兴奋剂行为，即国家机关和体育组织都有权力对违反兴奋剂的行为进行管辖，所有的主要的体育主管部门应共同携手反对兴奋剂 [2]。后来国际奥委会成立了由政府代表和体育运动代表共同参加的世界反兴奋剂机构，制定了《世界反兴奋剂条例》。联合国教科文组织（UNESCO）牵头开始了《反对在体育运动使用兴奋剂国际公约》制定过程，该公约的制定既是UNESCO与其他国际组织以及各国政府共同努力的过程，也是政府组织和非政府组织进行合作的典型示例。



内 容

1 制定《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》的必要性

在反对兴奋剂方面，尽管各国、地区间以及国际上通过了许多政府间的国际文件，但是没有一个是具有世界范围的法律效力的。适用范围较广的两个国际文件是《欧洲委员会反对兴奋剂公约》（及其附加议定书）和《反对在体育运动中使用兴奋剂的哥本哈根宣言》。《欧洲理事会反兴奋剂公约》在协调缔约国反兴奋剂的政策和实践做法以及提高签署国政府的反兴奋剂计划方面发挥了有效作用，不过，这个公约并不具有全球效力，只有四十多个国家批准了该公约，而且主要是欧洲国家。2003年通过的《哥本哈根宣言》是应对反兴奋剂活动的迅速发展而提出的，其主要目的是支持世界反兴奋剂机构和《世界反兴奋剂条例》，并呼吁“在2006年都灵冬季奥运会之前及时制定一个通过与各国政府的体制和行政管理相适应的文件予以实施的反兴奋剂公约或者确定所须承担的法律义务”。

截至2005年8月22日，尽管有175个国家签署了《哥本哈根宣言》［3］，但其并没有法律上的拘束力，而且内容不够全面，没有涉及到各国政府在反对在体育运动中使用兴奋剂方面所需解决的所有问题。

作为一个根据瑞士私法设立的基金会，1999年9月成立的世界反兴奋剂机构理事会由50%的政府组织和政府间组织的代表以及50%的体育组织代表组成，这种不同寻常的组成结构表明在反对兴奋剂方面各国政府和体育组织必须同心协力、共同行动这样一个事实，如果不相互配合和合作，任何一方都不能取得成功。各国政府和体育界都承认在反兴奋剂的活动中世界反兴奋剂机构起主要牵头作用。尽管已有许多体育组织签署了《世界反兴奋剂条例》，但是根据国际法，

《世界反兴奋剂条例》不具有法律约束力。因此，政府部门之间需要制定一项国际公约，规定各国政府在本国的法规中适用《世界反兴奋剂条例》所制定的原则而承担的义务。此外，各国政府在打击体育运动中使用兴奋剂的现象方面，还须在体育组织或世界反兴奋剂机构职权管辖范围以外的领域采取行动。这类行动必须与体育界按照《世界反兴奋剂条例》规定所采取的行动相配合，因为，如果这两种文件之间缺乏协调一致，则有可能被一些人所利用而肆无忌惮地长期在体育运动中使用兴奋剂。

因此，制定一项具有约束力的国际公约是必要的，特别有助于确保各国政府采取措施以反对在体育运动中使用兴奋剂的做法，同时配合体育运动界已经采取的行动，包括在国家层面实施的反兴奋剂活动、国际合作、教育和培训以及研究工作；而且也可以向世界反兴奋剂机构开展的反兴奋剂斗争提供支持，对《世界反兴奋剂条例》和各项《国际标准》给予支持。



2 《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》的制定过程

《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》一直是UNESCO最近几年关注的领域。2003年1月，UNESCO组织了一次由各国体育部长和高级官员参加的圆桌会议，其目的是在2006年都灵奥运会之前通过一个反兴奋剂国际公约。当年晚期，UNESCO第32届大会考虑到了这项建议，邀请总干事调查体育运动中的反兴奋剂问题并且起草一个国际公约。而对公约关

注的除了联合国教科文组织外，联合国大会于2003年11月3日也通过了有关体育运动促进教育、健康、发展与和平的第58／5号决议，其第7段指出，“政府应当加速制定一个适用于所有体育运动的国际反兴奋剂公约的进程，并且在制定公约方面要求联合国教科文组织和其他国际以及地区的组织进行合作”［4］。

UNESCO总干事于2003年组织了一个特别专家委员会并分别于当年的6月、11月和12月召开了三次会议，制定了《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》的初稿，交于2004年1月举行的由政府和体育组织代表参加的会议进行审查［5］。2004年5月，在巴黎召开了政府间会议，第二次讨论了公约的初稿。2004年9月，UNESCO总干事邀请该组织的190多个成员派代表出席于2005年1月在UNESCO总部巴黎举行的讨论《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》草案的第三次政府间会议。2004年12月，在希腊雅典举行的第四次国际体育部长和高级官员会议将兴奋剂列为三个主要的议题之一，其第一委员会对《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》的初稿进行了研讨，涉及如何执行公约、如何进行财政方面的援助以及如何与其他国际文件同时并存等［6］。

由此可见，公约草案是一个专家组三次讨论会和国际会议三次大会的成果，同时国际体育部长和高级官员第四次会议也讨论了公约草案并且帮助解决了几个比较显著的问题。在起草过程中，所有的国家政府都承诺要与体育运动中的兴奋剂进行斗争，这使得起草规则进展得非常迅速；不过，重要的是要意识到世界范围内的反兴奋剂斗争的发展是处在不同的阶段中的，要确保最终的公约符合所有国家的要求［7］。

制定公约的最新进展是，2005年8月22日，在斯洛伐克举行的《反对在体育运动中使用兴奋剂国际公约》的圆桌会议上，与会代表讨论了该公约以及政府和体育界如何实施《世界反兴奋剂条例》的问题。在该次会议上，UNESCO总干事指出当前反兴奋剂已经成为全球关注的问题，因此制定一个全球性质的国际公约是必要的；该公约将国际法的力量用在反兴奋剂的斗争中，并且要确保所有的政府都要从法律上承诺执行《世界反兴奋剂条例》；如果没有国际奥委会、国际残疾人奥委会、欧洲理事会以及世界反兴奋剂机构的帮助是不可能形成公约的最终文本的［8］。