主题：【资料】兴奋剂类分析方法系列讲座(40讲 待续)

兴奋剂类分析方法系列讲座（26）（下）微波萃取-气相色谱法测定尿液中的苯丙胺类毒品

2. 2. 4　溶剂用量对萃取率的影响

　　分别取环己烷2, 4, 6, 8, 10, 12 mL 作为萃取溶剂，在40 ℃下萃取10 min, 其余步骤同“1.5.1”节所述。结果表明:随着萃取溶剂用量的增加,萃取率明显增加,大于6 mL 以后,萃取率变化不大。故环己烷用量选择6 mL。

2. 2. 5　尿液pH值对萃取率的影响

　　取6 mL 环己烷作为萃取溶剂,在40 ℃的萃取温度下保持10 min，分别调节尿液的pH值为9， 10，11， 12，13和13.7,其余步骤同“1.5.1”节所述,结果(见图3)表明:在尿液的pH 值大于12 时, 萃取率变化不大。故选择pH值为12。



2. 3　标准曲线和最低检出限

　　向空白尿液中加入MA, MDA 和MDMA 的混合标准溶液,配制尿液中3种药物质量浓度分别为0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 m g /L 的系列标准溶液。按“1.5.1”节方法处理样品, 然后进行GC-F ID 分析。以药物峰面积(A )对药物质量浓度(C, m g /L )绘制标准曲线, 并求得直线回归方程和相关系数。最低检出限为按“1.5.1”节步骤处理样品所能检测到的尿液中的药物浓度(以3倍信噪比计算) , 结果见表1。3 种药物浓度为3 m g /L的日内和日间回收率和精密度见表2, 其中日内 ( In traday)为1 d 内重复测定5次的回收率和精密度, 日间 ( In te rday)为5 d 内冻融5 次测定的回收率和精密度。



2. 4　方法的回收率及精密度的测定

　　取空白尿液,准确加入MA,MDA 和MDMA 的混合标准溶液, 分别配制药物浓度为1, 3, 5 m g /L的尿液各5份,按“1.5”节所述两种方法处理样品,并进行GC-FID 分析,计算平均回收率和精密度,结果见表3。


2. 5　在法医案例中的应用

　　将该方法应用于测定法医案例中6例吸食苯丙胺类毒品者的尿液中MA,MDA 和MDMA 的含量,并且与公安部物证鉴定中心提供的数据(采用GC-MS测定)进行了比较。分析结果见表4 (括弧中的数据为公安部物证鉴定中心提供的数据,“ + ”为阳性结果) ,其中2号样品为冰毒吸食者的尿样,色谱图见图12c; 3号样品为摇头丸吸食者的尿样, 色谱图见图12d。



2. 6　GC-M S 定性分析

实验过程中,为了进一步增强检验结果的可靠性,我们还同时采用GC-MS 的全扫描模式对微波萃取的吸食苯丙胺类毒品者的尿液样品进行了分析。根据其保留时间和质谱图进一步确定了检材中的毒品成分。图4为表4中2号样品的总离子流色谱图和质谱图(冰毒的主要成分为MA,MA 的代谢产物为苯丙胺(AP ) ) ,图5为表4中3号样品的总离子流色谱图和质谱图(摇头丸的主要成分为MD 2MA,MDMA的代谢产物为MDA ) 。



3　结论

　　本文采用微波萃取技术对人体尿液中甲基苯丙胺、3, 42亚甲二氧基苯丙胺和3, 42亚甲二氧基甲基苯丙胺3种常见的苯丙胺类毒品的分析进行了研究,通过对微波萃取溶剂、萃取温度、尿液pH 值等微波萃取条件的优化,建立了同时检测人体尿液中甲基苯丙胺、3, 42亚甲二氧基苯丙胺和3, 42亚甲二氧基甲基苯丙胺的微波萃取2气相色谱分析方法。该法简单快速、高效,重现性好和回收率高。将该方法应用于6例苯丙胺类毒品滥用者的尿液的检测,

获得了理想结果。

兴奋剂类分析方法系列讲座(27)吸毒者死后生物检材中的药物及 

 
吸毒者死后生物检材中的药物及

毒品代谢产物分析



摘 要 采用直接GC-MS法、水解GC-MS法及水解-衍生化GC-MS法对一名吸毒者尸体上的尿样及肝脏检材进行系统分析，所得结论为法医确定死者死因提供了强有力的证据，建立的方法较为全面、实用，可供同行参考.



    本文由云南省玉溪市公安局的苏少明、李绍鹏、柴育芳和甘肃政法学院公安分院的俞文等刑事技术工程师们共同完成，可供刑事技术同行们参考，现全文介绍如下。



前 言

近年来，我国在逐步加大毒品犯罪的打击力度，实行“三禁并举、堵源截流”的禁毒策略，在禁毒工作中取得了一次又一次的重大胜利，但目前的毒品犯罪仍然十分猖獗，毕竟“冰冻三尺-，非一日之寒”。因而每年仍有大量的吸毒者因吸毒过量或因吸毒导致疾病死亡，是吸毒过量中毒死亡？还是因长期吸毒致机体脏器发生器质性病变死亡？这是摆在法医和毒化工作者面前的一道难题。这就需要法医对尸体脏器进行病理切片，同时也需要毒化人员对死者生物检材进行系统的药毒物分析才能最终得出结论。关于吸毒者死后生物检材中药毒物的分析已有过文献报道，作者或对尿液或对肝脏进行分析，但像本工作对同一吸毒死者的尿液及肝脏进行如此全面地分析的报道还不多见。本工作除报道分析方法外，还对检出的药毒物的代谢途径进行了解释。



1 实验部分

1.1 主要仪器

美国PE公司QMASS-910气质联用仪；瑞士BUCHI公司R3000旋转蒸发仪。

1.2 主要试剂

丙酮\、醋酸锌、无水硫酸钠、二氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、异丙醇、浓盐酸均为分析纯；BSTFA+TMCS：V(BSTFA)：V(TMCS)= 99：1，sigma公司产品。

1.3 分析条件

1.3.1  肝脏提取物分析条件

色谱柱TMPTE-5  30m×0.25mm石英毛细柱 ‘SUPELCO公司产品；进样口温度270℃；柱温以10℃/min自200℃（1min）升温至280℃（20min）；传输线温度250℃；离子源温度250℃；倍增器电压1300V；EI源70eV载气气压0.3Mpa；扫描范围m/z 50~450；不分流进样’0.8min后打开分流阀。

1.3.2  尿液提取物分析条件

色谱柱同上石英毛细柱，进样口温度270℃；柱温以15℃/min自80℃（1min）升温至200℃（1min）；再以15℃/min升至290℃（30min）；传输线温度250℃；离子源温度250℃；倍增器电压1300V；EI源70eV；载气气压0.3Mpa；扫描范围m/z 45~450；分流比30：1。



2 检材处理

2.1 肝脏前处理方法

取20g肝脏绞碎，置于50mL具塞三角瓶中，加入丙酮30mL浸没，超声提取30min，加

入1g助滤剂混匀，置高速离心机上离心15min（8000r/min），过滤入蒸发皿中，于45℃水浴上挥去丙酮，加入.1g左右的醋酸锌，充分搅拌后过滤入100mL分液漏斗中（滤纸应尽可能地小），先加入约40mL二氯甲烷，立即加入约20g无水硫酸钠，边振摇边加入无水硫酸钠至澄清，分出二氯甲烷液，再用约20mL二氯甲烷液振洗一遍，用洗耳球吹出硫酸钠中残存的二氯甲烷，合并，浓缩至近干，甲醇定容至.100μL供分析。

2.2 尿样的前处理方法

先用万华普曼生物工程有限公司的万华牌吗啡胶体金检测试纸检测呈阳性后作如下处理：取尿样5mL，加浓盐酸0.5mL，沸水浴上加热1h，取出放冷，调pH = 9，用V（乙酸乙酯）：V（异丙醇）= 9：1 40mL分两次提取过无水硫酸钠脱水，挥干。加入40μL乙酸乙酯溶解残渣，并加入40μL BSTFA+TMCS（99：1），涡旋混合，于70℃水浴上加热10min后，取出放冷供分析。




3 结果及讨论

死者肝脏直接提取物的TIC图示于图.1。图1中A峰为咖啡因，B峰为安定，C峰为去甲安定。

死者尿液酸水解提取物硅烷化产物的TIC图见图2。图2中A峰为2-氨基-5-氯二苯甲酮（ACB）、B峰为2-甲氨基-5-氯二苯甲酮（MACB）、C峰为吗啡的硅烷化产物。



本例中从肝脏中仅检出咖啡因、安定及去甲安定，未检出吗啡（硅烷化后也无法检出），而尿中则检出吗啡。可能是因为死者的死亡时间过长，毒品代谢产物在肝脏中存留少的缘故。所以在进行该类案件的鉴定时，一定要注意提取死者的尿液进行检验。

从本例的分析结果来看，安定的代谢途径应该示于图3，MACB、ACB只分别是安定和去甲安定的酸水解产物，而非安定的体内代谢产物。笔者曾对安定纯品酸水解后进行GC-MS分析，结果仅检见MACB，由此可证明MACB是安定的酸水解产物。

本工作所建立的酸水解-衍生化法检测吸毒者体内的药毒物成分的方法较实用，有利于在基层推广。

兴奋剂类分析方法系列讲座（28）类固醇兴奋剂分析方法的研究进展 


类固醇兴奋剂分析方法的研究进展



摘 要：蛋白同化雄性类固醇是一类滥用最为普遍的兴奋剂物质，对其进行有效的控制和检测关系到运动员的身心健康和体育比赛的公平公正。对类固醇兴奋剂分析方法的改进和发展是目前兴奋剂检测的重要任务。本文主要是对白2002年以来类固醇兴奋剂样品的预处理和检测手段的研究进展做一概述，包括气相色谱－质谱法、液相色谱－质谱法、免疫法、电化学方法以及质谱法等。



本文由北京分子科学国家实验室 北京大学化学与分子工程学院的龙媛媛、王丁众、李克安、刘锋等研究人员发表在《色谱》杂志上2008年的论文，他们综合性介绍了多种分析内固醇的新方法和研究进展，值得参考（第一作者E－mail：longyuanmagic＠163． com）。现全文介绍如下。



前 言

类固醇是广泛分布于生物界的一大类环戊稠环全氢化菲衍生物的总称，又称甾醇、甾族化合物。其分子骨架结构是由3个六碳环己烷和1个五碳环组成的稠合四环。天然类固醇类分子中的六碳环均呈稳定的椅式构象，唯一的例外是雌激素分子内的一个芳香环为平面构象。类固醇类物质依据其结构性质和生理作用的不同可以分为很多类，包括固醇（如胆固醇、羊毛固醇、谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇）、胆汁酸和胆汁醇、类固醇激素（如肾上腺皮质激素、雄激素、雌激素）、昆虫的蜕皮激素、强心苷（如毛地黄毒苷）、皂角苷基和蟾蜍毒等。此外还有人工合成的类固醇药物（如抗炎剂、促进蛋白质合成的药物和口服避孕药）等［1］。

绝大多数类固醇类物质均具有生理活性，尤以蛋白同化雄性类固醇的活性较为显著。其蛋白同化作用可以增加蛋白质合成，促进肌肉发达和红细胞生成，增强力量和耐力；而雄性激素作用可以使男性性特征更加明显。正因为如此，早在20世纪50年代，前苏联举重运动员开始通过服用雄性激素睾酮增加力量［2］。到20世纪60年代，竞技运动员使用类固醇激素的现象已非常普遍，因而国际奥林匹克委员会（IOC）将这类物质判定为兴奋剂而明令禁止。

然而时至今日，在所有禁用物质当中，蛋白同化雄性类固醇仍然是滥用最为普遍的物质。有报道称大约5％～14％的美国大学体育总会运动员服用过类固醇激素，而健美运动员滥用类固醇激素的比例高达30％～75％[3]。在2004年希腊雅典夏季奥运会上，世界反兴奋剂机构（WADA）共查出23例阳性尿样，其中有16例与蛋白同化类固醇激素有关［4］。类固醇类兴奋剂的滥用严重影响到体育比赛的公平公正性，且长期使用这类兴奋剂会严重干扰人体的自然激素平衡，导致异性化现象，还可能引起严重的肝、肾损伤，并发肝癌、心脏病，并产生药物依赖，少数人还可能出现严重的情感及精神病症［5］。因此，如何对类固醇激素进行有效的控制和分析检测是人们一直关注的热点问题。

蛋白同化雄性类固醇可分为两大类：一类是人体自身能分泌的，称为内源性激素；另一类是人体自身不能分泌而经人工合成的，称为外源性激素。2008年WADA列出的禁用清单中，指定包括诺龙、甲睾酮、群勃龙等在内的46种物质及其他具有相似化学结构或生物作用的物质为禁用的外源性蛋白同化雄性类固醇［6］。判断是否使用了外源性类固醇激素比较简单，只要通过可靠的方法在体内查到该物质或其代谢物或标记物即可认定。而判断是否使用了内源性类固醇激素则复杂得多，简单的定性分析是不够的，必须区分它们的来源是自身分泌还是人为摄人，只有人为摄人才能判定其使用了兴奋剂。因此，针对不同类型的类固醇激素，其测定方法存在—定的差异。

类固醇激素在体内的代谢过程非常复杂，因此其大部分需通过其代谢物进行测定，而所检测的样品包括血样、尿样和毛发等均具有复杂的基底干扰。因此一般的分析方法都需要包含色谱分离过程。目前IOC规定的合成类固醇类物质的标准分析方法是采用气相色谱－质谱（GC MS）方法分析尿样，而液相色谱（LC）－MS方法由于具有更高的灵敏度和特异性也得到了广泛的重视和长足的发展［7］。此外，利用免疫法及电化学方法对类固醇物质进行定性和定量分析也取得了一定的进展。另一方面，样品预处理过程复杂、耗时长是目前限制各种分析方法发展的主要因素，对样品预处理方法的改进和发展也有很多研究报道。本文总结了2002年以来蛋白同化雄性类固醇兴奋剂样品预处理和分析方法的研究进展。



1  类固醇兴奋剂的GC-MS分析

外源性雄性类固醇种类相对较多，且在体内代谢过程复杂，因而对检测方法的灵敏度和特异性要求较高。目前IOC规定的合成类固醇检测标准主要是采用GC－MS分析尿样，选择特定的特征离子进行监测［8］。尿样一般先经酶解除去蛋白质等生物大分子，之后经固相萃取或液－液萃取对目标物质进行初步的分离富集，将得到的被分析物进行三甲基硅烷化衍生后即可进人毛细管气相色谱分析，常通过四极杆质谱监测特征离子［9］。这类方法对绝

    大多数外源性雄性类固醇能够获得比较可靠的分析结果。然而随着各种新型类固醇激素的出现和兴奋剂禁用清单的扩大，以及对分析速度和效率的要求不断提高，近年来GC－MS方法也在不断地被改进和优化[l0,1l]

Marcos等[12]利用GC MS／MS方法对50余种类固醇物质进行了分析，引入的外部电离的离子阱质谱在原有一级质谱的基础上大大降低了背景干扰，提高了分辨率。选择适当的碎片离子能在提高灵敏度的基础上缩短分析时间，实现在7.4 min内将50余种被测物全部检出，检出限均低于0.5ng／mL。使用该方法对100余个实际尿样进行测定，得到了比较满意的结果。他们［13］还将高效液相色谱（HPLC）与GC－MS相结合，样品经过HPLC预分离之后再进行衍生化，最后进行GC－MS分析，质谱检测采用全扫描模式。结果表明改进的方法可以大大降低干扰物质的影响，在2 ng／mL的极低浓度下能够得到所有被分析物的全扫描图谱。Huenerbein等［14］对司坦唑醇等几种类固醇兴奋剂及其代谢物的GC测定条件进行了优化。司坦唑醇的结构稳定，硅烷衍生化较为困难［15］，因而测定时初始炉温一般较高，为180℃左右，然而在此温度下与其共存的氧雄龙等物质会发生分解[16］。作者以司坦唑醇被全部衍生化和氧雄龙、克伦特罗等物质的测定灵敏度不受影响为检测原则，考察了初始炉温对测定结果的影响，结果表明初始炉温设定为140℃最为理想。

新型类固醇激素的出现对分析方法的改进和发展提出了进一步要求。一方面需要对其在体内的代谢过程进行深人的了解，以寻找适当的分析标记物［17,18］；另一方面要根据其结构和性质选择适当的分析手段。Catlin等［19］对新近出现的四氢孕三烯酮（THG）的合成和检测方法进行了研究，分别用LC－MS和GC－MS方法对未衍生化及经硅烷衍生化的目标物进行了测定，并通过动物实验证明该物质主要是通过尿样排泄，因此尿样分析可作为可靠的监测手段。Sekera等［20］考察了脱氧甲基睾酮的发现、制备过程及其尿样分析方法。脱氧甲基睾酮是2007年被列人兴奋剂禁用清单的类固醇激素物质，实验表明通过甲基硅烷化衍生后进行GC-MS分析可以得到较好的测定结果。在类固醇激素分析过程中，一般需要在样品中加入内标物质，以对方法的可靠性进行验证。内标物一般为被分析物的氘代结构类似物。为了满足不同目标物质的测定要求，目前对氘代雄性类固醇物质的合成与表征也有较多研究［21］。Gdrtner等在这一领域做了较多工作。他们分别合成了五氘代雄甾酮葡萄糖苷［22］、五氘代司坦唑醇［23］及氘代雄甾酮［24］，并将其用作GC－MS分析尿样时的内标物质，均得到了满意的测定结果。

兴奋剂类分析方法系列讲座（28）-(2)类固醇兴奋剂分析方法的研究进展


毛发样品分析在司法鉴定中已经占据了相当的地位，但是目前还未被世界反兴奋剂机构所采用。由于绝大多数药物均可随着血液循环在角蛋白中累积，且与尿样和血样相比，毛发样品更为稳定，可以反映长期服药效果，因此目前对于毛发样品中类固醇类兴奋剂物质的分析也有较多报道。分析方法一般是采用强酸或强碱溶解毛发样品，之后经固相萃取或液－液萃取，萃取产物经过三甲基硅烷化衍生后通过GC-MS／MS分析［25］。然而，研究表明不同人种的毛发对药物的结合能力有较大的差异；同时，使用化妆品、染发等因素亦会对分析结果产生影响，因此毛发分析只能作为尿样分析的补充，而不能完全代替尿样或血样分析［26］。一般对于长期服用类固醇激素的情况，如一些健美运动员，通过对毛发样品的分析可以更准确地反映其对类固醇兴奋剂反复多次的摄人情况，获得尿样和血样分析无法提供的信息［27］。

对外源性类固醇激素的分析目前已经较为成熟，兴奋剂使用也转人了更隐蔽、更难以检测的内源性兴奋剂的阶段。对外源性兴奋剂，在体内一经查出即可判定为阳性。而内源性兴奋剂则需要“通过可靠的分析方法表明检测到的禁用物质属于外源性来源”［6］。目前一般利用同位素比质谱的方法对人体自身生成与外源引人的物质加以区分。同一来源的物质其13C与12C 同位素比值（13C/12C）是相同的，类固醇激素商业产品通常单—来源于大豆等植物中提取的植物甾醇，其13C/12C值较低。而人体自身产生的类固醇激素的13C含量则反映了食用的动物和植物分子13C同位素的累积及在人体内的代谢，其13C/12C值较高。因而通过同位素比质谱法测定人体内类固醇激素的13C/12C，即可确定其来源[3,28]。
2  类固醇兴奋剂的LC－MS分析

与GC相比，HPLC一般在室温条件下工作，能分离沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的物质，比较适合于分析生物和医药学上的大分子物质，如蛋白贡、核酸等。对于类固醇兴奋剂的分析检测，由于经常采用尿液、血液等含有复杂基质的物质，因此用HPLC法进行分离是定量检测的前提。由于HPLC分离能力强而定性和定量检测能力有限，一般串联定性、定量和结构分析能力更强的MS检测器。LC－MS已成为类固醇兴奋剂分析的重要手段，它很好地弥补了常用的GC－MS方法的不足，可用于检测一些浓度低、代谢快的类固醇，如司坦唑醇［15］，甚至可作为评价其他分析方法优劣的标准［29］。但兴奋剂滥用日趋严重，因而对目前检测方法的改进和对新的分析方法的发展仍然是研究的热点。

兴奋剂种类繁多，根据世界反兴奋剂条例2008年禁用清单，大体上可分为蛋白同化制剂、肽类激素和相关物质、β2－激动剂、荷尔蒙拮抗剂以及调节剂等几类。不同兴奋剂之间都有或多或少的异同，因此同时测定多种兴奋剂非常困难。目前，科学工作者正在努力对某一类［28］或几类［30］具有共同基团的兴奋剂进行测定研究。Mazzarino等［31］研究了同时检测糖皮质激素、β2ˉ激动剂（福莫特罗、莫达非尼、美索卡）、抗雌激素（非那雄胺、依西美坦、阿那曲唑、来曲唑、福美坦）、蛋白同化雄性类固醇（司坦唑醇、孕三烯酮、四氢孕三烯酮）的方法。这些兴奋剂可以经β－葡萄糖苷酸酶分解后在碱性环境下用液－液萃取预处理，然后用LC－MS／MS在阳离子模式的电喷雾离子化和多重反应监测模式下进行分析，结果显示糖皮质激素、抗雌激素和类固醇的检出限可以达到1～30 ng／mL，激动剂的检出限可以达到100～200 ng／mL，且所有的被分析化合物的保留时间和相对丰度都有良好的重现性。该方法的突出优点是分析时间短，LC－MS／MS过程只需7 min，费用也比传统的LC－MS／MS方法低，较适用于常规兴奋剂的检测。

对于某些常见兴奋剂分析方法的改进和发展也是研究的重点。例如WADA在2004年的统计中指出：已检测出的兴奋剂中36％是与代谢相关的制剂，其中24％是诺龙。因此研究特定兴奋剂的快速、高灵敏度的分析方法也是非常必要的。Tai等［32］用同位素稀释液相色谱－串联质谱检测人尿液中的19－去甲雄酮（19－NA）。19－NA是诺龙的主要代谢物，分别以葡萄糖苷酸复合物、硫酸盐和单体等形式存在于人尿液中，其中以第一种为主。他们将19－NA葡萄糖苷酸复合物用酶处理后加入氘代19－NA作为内标，经液-液萃取后用反相LC－MS／MS测定，分析结果显示该方法具有良好的抗干扰能力、精确度和重现性，测得的19－NA葡萄糖苷酸复合物水解为19－NA的产率也与理论计算值相近。对单一兴奋剂的检测方法研究也为同时检测多种兴奋剂提供了技术支持。Friedrich等［33］研究出一种用皮质酮为内标分析人体肝细胞中印－羟基睾酮的反相高效液相色谱（RP-HPLC）方法。该方法首先用预处理柱进行在线样品富集，依次用甲醇、四氢呋喃和水反向冲洗进行梯度分离，然后经常压化学电离（AP－CI）进入串联质谱，采用选择反应监测模式得到检测结果。该方法通过更改在线分离富集条件即可用于定量分析一系列生物活性物质，包括血浆、尿液和组织中的外源性类固醇兴奋剂。

液相色谱－质谱联用能够迅速发展的关键是软离子化技术的实现。常用的有电喷雾离子化（ESI）［30,31，34－41］、APCI［33,39,42］、常压光致电离（APPI）、基质辅助激光解吸离子化（MALDI）等。Leinonen等［43］分别对ESI、APCI和APPI这3种离子化技术用于LC-MS／MS分析尿样中代谢类固醇的实验条件进行了优化，并从特异性和检出限两方面进行了比较。结果显示这3种离子化技术均满足常规分析要求，其中LC／ESI－MS／MS在最优条件下检出限可达0.4～4 ng／mL，低于用APCI和APPI得到的7 ng／mL，适用性最佳。

应用LC－MS分析的样品多数是尿样，其易于获取且含有大部分人体代谢产物、液体形态易于保存和预处理。然而尿液本身成分复杂，分析结果受内源性物质和结构类似物质干扰较大，因此目前也有对血液［44］、粪便［39］、毛发等其他样品的分析研究。Nielen等［38］研究了分析牛毛中未遭破坏的17β－睾酮和17β－勃地酮十一碳烯酸酯的方法。该方法只需200 mg粉碎的牛毛样品，用三（2-羰基乙基）磷酸盐（TCEP）在温和条件下消化，取样注射进入LC-MS／MS分析系统，用同位素稀释法得到该方法的检出限为2～5 ng／g，精确度为97％～105％。在此基础上他们对LC-MS／MS方法进行了改进，利用串联四极杆质谱的多重反应监测功能同时分析多种类固醇化合物，每种被分析物至少经历了两次MS／MS转换，而无需二次注射，这种分离检测模式具有高灵敏度、高选择性和稳定性强等特点。

由于利益驱使，人工合成的新型兴奋剂不断出现，用以逃避常规的兴奋剂筛查，这给体育比赛公平竞争带来了很大的挑战。因此，预测未知兴奋剂的存在并发展相应的分析方法，已成为目前兴奋剂分析检测研究的重要任务。传统的方法是找到其制备过程，测定生物活性，同时用核磁（NMR）和质谱确定结构，再发展出分析方法。这个过程耗时较长，并不实用。鉴于此，Nielen等［41］发展了通过同时研究激素生物活性和鉴定质谱结构来分析尿液中微量类固醇的方法：样品通过酶解和固相萃取，经梯度液相色谱分别进入两个同样的96-阱碎片收集器；一部分样品直接进行生物活性测定，另一部分根据测定的结果来确定下一步的工作。在测定结果中若有生物活性，则将其注人高分辨的反相LC，用精确的电喷雾四极杆飞行时间质谱进行分析，确定化合物结构。这种方法有效地补充了目前已有的含已知目标

    代谢物尿样的分析方法，能够提高未知的人工合成类固醇兴奋剂的检出率。

用LC－MS／MS方法分析尿样可以简化繁琐的衍生化步骤，一定程度上避免了直接测定成对的代谢类固醇，但具有类似结构的内源性化合物会干扰测定，降低结果的可靠性。Pozo等［40］研究了用MS／MS转换来消除这些干扰。他们通过选择特殊的前驱离子以彻底消除干扰，如采用［M＋H＋MeOH］+ 为前驱离子可以有效地提高检测l－睾酮、5β-雄-1-烯-l 7β-醇-3-酮以及氧雄龙的选择性。他们还发展了一种利用前驱离子谱鉴别内源性干扰中是否含有类固醇或皮质类固醇结构的方法，有可能用于预测样品中是否存在未知人工合成类固醇。

LC-MS技术，尤其是近年来广泛应用的LC－MS／MS技术，综合了LC强大的分离能力和质谱强大的定性定量分析能力，以其高灵敏度、高特异性、高通量以及预处理简单等优越性在兴奋剂分析检测中占有重要地位。LC－MS的广泛应用使得许多无法或很难用GC－MS分析的兴奋剂得到了很好的检测。目前LC－MS的发展集中体现在缩短分析时间、提高液相色谱分辨率、提高信噪比、达到更低的检出限和更高的

兴奋剂类分析方法系列讲座（28）-(3)类固醇兴奋剂分析方法的研究进展

检测通量［45］。新发展的LC－MS方法要成为WADA认定的兴奋剂检测方法，关键在于制定合适的测定标准，而目前只有小分子质量的兴奋剂具有比较成熟的测定标准，因此建立统一的LC－MS方法测定标准具有重要的意义。
3  类固醇兴奋剂的其他分析方法

GC-MS和LC－MS是目前类固醇兴奋剂分析的主流方法，但这些方法由于涉及色谱分离过程而相对耗时较长，且对样品的预处理有较高的要求。目前也有许多采用其他方法（如免疫法、电化学方法以及质谱法等）分析类固醇物质的文献报道。这些方法的发展为实现类固醇兴奋剂快速、高灵敏度和高特异性的测定提供了可能。

考虑到实际需要，检测类固醇类兴奋剂的方法要具备快速、简单、检测费用低，以及能够满足生物样品用量较少等测定要求。免疫法由于利用抗原与抗体的特异性免疫反应，能够达到较高的灵敏度和特异性。目前该法应用于类固醇类兴奋剂分析已有一些报道。

免疫法中最常见的是酶联免疫吸附法（ELISA），相对于GC－MS和LC－MS，ELISA方法的研究还处于起步阶段，目前集中于对睾酮及其代谢产物的分析［46j。睾酮是最常见的一种内源性兴奋剂，其代谢产物主要有脱氢睾酮和甲基脱氢睾酮等，对这些化合物分析方法的研究有助于确立通用的研究思路，建立普适的分析方法。Kramer等［47］将脱氢勃地酮半抗原和甲基脱氢勃地酮半抗原与匙孔虫戚血蓝蛋白（KLH）偶联，通过腹部注射免疫小鼠和兔子，产生相应的单克隆和多克隆抗体。利用ELISA方法测定17β－脱氢勃地酮和甲基脱氢勃地酮，检出限分别达到0．13 mg／L和0．54 mg／L，能够满足加标尿样的测定要求。Salvador等［48］制备了THG的多克隆抗体，与牛血清白蛋白（BSA）偶联后建立了对THG的竞争性ELISA方法，在缓冲溶液中检出限可以达到（0．045±0．015）μg／L，对经过简单预处理的实际尿样检出限可达到（0．25±0．14）μg／L。该方法的样品预处理简单，无需萃取和水解，盲测样分析结果表明具有较好的精确度。Hungerford等［49］发展了一种通用的ELISA方法用于分析尿样中17α-烷基合成类固醇的代谢物，并对摄入司坦唑醇的马进行尿样分析，测定结果与用标准LC－MS方法一致，可以用于对已知兴奋剂进行初步筛查。

除了ELISA方法，各种免疫传感器也陆续得到应用。Lu等［50］研制出一种检测尿样中的勃地酮和甲基勃地酮的电化学免疫传感器。免疫传感器以计时安培分析法为基础，将勃地酮－BSA固定于电极表面，根据游离的被分析物和固定于电极表面的分子与相应抗体的竞争性结合进行检测。尿样经简单的稀释后无需萃取和水解即可直接测定。由于勃地酮与其抗体之间具有高的交叉反应性，因此该方法能有效地同时测定勃地酮及其主要代谢物。用免疫方法检测其他兴奋剂或兴奋剂代谢物的研究也有一些报道，如Kreuzer等［51］报道了一种基于定量生物传感器原理检测类固醇残余物（以司坦唑醇为例）的局部表面等离子（localised surface  plasmons，LSPs）方法。该方法免于标记，具有较高的特异性，且与原理类似的表面等离子体共振（SPR）方法相比较，具有仪器结构简单、花费低等优势。

电化学方法因其不需要复杂的样品预处理和衍生过程而在环境、医药监测等方面发挥重要的作用，但由于其检测通量不高，因而目前在兴奋剂检测领域还没有得到广泛的应用，只是针对一些特定的具有电活性的物质发展出相应的电化学分析方法[52]。Groyal等［53，54］利用循环伏安法、示差脉冲伏安法和方波伏安法构建了对诺龙的电化学分析方法。他们使用金纳米颗粒修饰的铟锡氧化物电极［54］，在示差脉冲伏安法下得到的线性范围为50 nmol／L～1.5μmol／L，检出限为1.36×l0-7 mol／L；使用富勒烯修饰电极研究了诺龙的电化学行为［53］，结果表明修饰电极与裸玻碳电极相比，对诺龙表现出更好的催化活性，利用方波伏安法得到的线性范围为0.1nmol／L～50 μmol／L，检出限为0.42 nmol／L。上述两种方法均用于对人血清中和尿液中诺龙的测定，与GC－MS测定结果有很好的一致性。

质谱方法是目前类固醇兴奋剂检测中通用的结构鉴定及定量测定手段。通常GC或LC与MS联用，由于涉及色谱分离过程而需要耗费大量的分析时间，因此单纯利用MS本身的分离能力进行测定具有诱人的发展前景。Kosanam等［55］验证了真空基质辅助激光解吸离子化（Vacuum matrix－assisted laser desorption ionization，vMALDI）结合线性离子阱质谱可以作为一种快速、高通量筛查兴奋剂的手段。他们考察了3种基质溶液，最终选择了在较低的质量范围（m／z 100～700）内没有干扰峰的四（五氟苯基）卟啉（F20TPP）作为基质溶液，对加标尿样中5种雄性类固醇激素进行定性和定量测定，检出限和线性范围分别为0.03 ng／mL和0.1～100ng／mL。这种方法不采用色谱分离即可得到比较好的检出限和线性范围，因而可作为一种快速有效的粗筛方法。

4  类固醇兴奋剂的样品预处理方法

具有复杂基底的人血清样品、尿样及毛发样品在进行GC-MS或LC－MS分析之前均需要进行预处理，以除去蛋白质、无机盐等干扰物质，同时对被分析物进行富集浓缩。目前一般的预处理方式是首先酶解除去蛋白质等生物大分子，之后通过固相萃取（SPE）或液-液萃取对目标物进行富集，特别是对于GC－MS分析方法还需要在进人气相色谱前对目标物进行衍生化。这一样品预处理过程对于绝大多数类固醇兴奋剂均能获得较好的分析结果，但耗时较长，过程复杂，已成为限制快速高通量的兴奋剂分析方法发展的因素之一。因此对于样品预处理过程的改进有较多的文献报道。

基于低成本的多孔性聚丙烯纤维而进行的液相微萃取（LPME）是一种较新的样品预处理方法，目前多应用于药物分析与环境监测方面，能够与多种分析测试技术如毛细管电泳（CE）、GC、LC、GC－MS以及LC－MS联用［56］。与传统的萃取方法相比较，液相微萃取方法具有富集倍数高、杂质干扰小、操作简单、成本低、使用有机溶剂的量少及方法适用范围广等特点，适用于复杂基底样品中类固醇兴奋剂的分离富集。Kuuranne和Rasmussen等［57］发展了一种快速、直接的LPME方法，用于分离富集尿样中葡萄糖苷化的类固醇，并与LC－MS／MS方法结合进行类固醇兴奋剂的定量测定。Leinonen等［58］利用两相LPME萃取尿液中游离态的合成代谢类固醇，考察了不同的有机溶剂、萃取时间、盐析程度及温度对萃取过程的影响，发展出在纤维上同时对类固醇进行萃取和衍生化的预处理方法。样品经处理可直接进行GC－MS分析，与常规液－液萃取方法所得结果一致。

我们课题组在内源性类固醇兴奋剂睾酮的样品预处理方面做了一些工作。采用分子印迹技术制备了一系列对睾酮具有特异性识别作用的硅胶或聚合物材料。以离子液为溶剂和致孔剂，采用纳米浇铸和牺牲空间印迹技术制备了新型的具有介孔结构的睾酮印迹硅胶［59］。通过在硅胶微球表面共价接枝偶氮类引发剂［60］，再利用紫外光引发聚合得到睾酮印迹的接枝型分子印迹聚合物薄膜。对上述材料性能的研究表明，合成的分子印迹材料对睾酮表现出较高的特异性识别能力，且具有结合位点易接近、传质速度快等优点，有望用作固相萃取填料、液相色谱固定相或传感器的敏感材料。

我们还利用双水相体系发展了对尿样中的睾酮和表睾酮分离富集的新方法。双水相萃取体系与传统的固相萃取或液－液萃取体系相比，具有操作简便、条件温和、高效、环保等优点，可作为一种简便、高效、环保的样品预处理手段。我们分别将离子液［C4 mim］Cl-盐-水［61」（其中［C4 mim］代表1－（正）丁基－3－甲基咪唑正一价离子）和异丙醇-盐-水这两种双水相［62］体系用于内源性类固醇类兴奋剂的富集分离，研究了双水相体系的分相机理，探讨了睾酮、表睾酮和甲睾酮在双水相体系中的分配行为及其影响因素。研究表明，双水相体系可作为实际尿样中睾酮、表睾酮预富集分离的手段，克服了现有方法步骤较多和使用有害有机溶剂等缺点，具有简便、快速、萃取率高和环保等优点，与RP－HPLC方法结合，能用于实际尿液中睾酮和表睾酮的同时测定。

兴奋剂类分析方法系列讲座（28）-(4)类固醇兴奋剂分析方法的研究进展



5  总结与展望

综上所述，雄性类固醇激素作为滥用最为广泛的一类兴奋剂，目前对其进行分析和测定的方法多种多样，但从满足快速、高通量的实用性角度来看，GC－MS和LC－MS仍然是最普遍和通用的方法。两种方法均能够得到较高的测量精度，易于实现标准化，但均需要复杂耗时的样品预处理过程，测定灵敏度也受限于配套的检测器，因此对仪器设备要求较高。其中GC－MS能够在一次测定中得到几十种类固醇物质的信息，并且GC的分辨率优于LO，因此GC－MS方法应用得更多。而LC-MS方法不需要对样品进行衍生化，且测定灵敏度高，适合于分析一些浓度低、代谢快的物质。因此两种方法互为补充，在兴奋剂检测领域均发挥着重要作用，也是目前人们研究的热点。

同时，为了简化分析步骤，提高测定灵敏度和特异性，人们提出和发展了很多其他方法，包括免疫法、电化学方法以及质谱法等，这些方法的共同特点是样品不需要经过复杂的预处理过程，缩短了分析时间。但方法的样品通量还不能满足大量测定的需要，因此未能获得广泛应用。在实际测定中可将其与GC－MS或LC－MS方法相结合，实现从粗筛到定量的快速、准确测定。

随着兴奋剂检测方法的不断改进和发展，某些运动员使用兴奋剂的手段也更加隐蔽和复杂，从而给准确、快速的筛查带来一定困难。为了满足兴奋剂检测的要求，发展在线样品预处理、高通量、高灵敏度的分析方法是未来几年的必然趋势。而对现有复杂、繁琐、耗时长的样品预处理方法的改进以及新型的快速、高效、环保的样品预处理体系的发展也具有重要的实际意义。

兴奋剂类分析方法系列讲座（29）头发中内源性类固醇激素的GC-MS分析 
 
头发中内源性类固醇激素的GC-MS分析





摘 要：建立了建康人头发中内源性类固醇兴奋剂睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮的气相色谱-串联质谱（GC－MS／MS）分析方法。头发经碱水解后，以乙醚提取，经衍生化后采用GC－MS／MS的多反应监测模式（MRM）分析。方法的线性关系良好，检出限达0.1～0 2 pg／mg；提取回收率为74.6％～104.5％；日内测定的准确度为90.1％～113.7％，日内及日间测定的精密度均小于17.5％。应用所建立的方法测定了80例中国健康人头发中睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮的生理水平，为内源性类固醇兴奋剂滥用的判断提供了方法和基础数据。



    本文由司法部司法鉴定科学技术研究所，上海市法医学重点实验室的沈敏、向平、沈保华和王萌烨等四位研究人员做了大量头发中对合成类固醇兴奋剂检测的基础性研究实验，现将他们的论文介绍如下。



前 言

随着国际竞技体育领域反兴奋剂力度的加大和兴奋剂检测技术的发展，部分运动员更多地选择使用隐蔽性更强的内源性类固醇兴奋剂。内源性类固醇激素由人体自身分泌产生，主要包括睾酮（testosterone）、表睾酮（epitestosterone）、雄酮（androsterone）、苯胆烷醇酮（etiocholanolone）和脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）等。由于常规的尿液分析难以区分目标物内源性类固醇激素的来源，因而内源性类固醇激素检测结果的评判至今仍是兴奋剂检测中的一个难题，各国反兴奋剂研究人员试图通过多种途径寻找判定依据［1~5］。

毛发中常见滥用药物分析已有较长的研究和应用历史［6,7］，其证据性质已得到大部分国家的法庭认可。毒物分析工作者根据以往研究的积累，认为毛发分析在兴奋剂检测领域应有良好的应用前景，并试图利用毛发分析的长检测时限和反映用药史的特点来判断是单次还是长期滥用兴奋剂，以替代“飞行药检”；利用毛发中药物原体大于代谢物的特点鉴别进入体内目标物的形态（酯或衍生物），有望区分外源性和内源性物质，提供运动兴奋剂滥用的辅助证据。

本研究是毛发中合成类固醇兴奋剂检测的基础性研究工作，即建立气相色谱¨串联质谱（GC－MS／MS）分析头发中内源性类固醇睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮的方法，测定中国正常人群头发中内源性类固醇激素的水平，为内源性类固醇兴奋剂滥用的判断提供了方法和依据。



实 验

1  实验部分

1．1  药品与试剂

睾酮、表睾酮、DHEA、雄酮、苯胆烷醇酮和D3-睾酮（内标）标准品购自Cerilliant公司和国家麻醉品实验室，黑色素（melanin）和甲醇购自Sigma公司，衍生化试剂N－methyl－；N－ trimethylsilyl－trifluoroacetamide（MSTFA）和碘代三硝基甲烷购自Sigma－Aldrich公司，DL－二硫苏糖醇购自Fluca公司，其他试剂均为国产分析纯。

1．2  样品制备

头发样品采自中国健康志愿者，其中45名男性，35名女性。头发均为贴头皮采集3 cm长，并置于室温下保存。

头发样品分别用0．1％十二烷基磺酸钠（SDS）、0．1％洗洁净、丙酮振荡洗涤一次，晾干后剪成2～3 mm长度，保存供检。

称取处理的头发样品50 mg，加入100 pg  D3-睾酮（内标）、1 mL  1 mol／L Na0H溶液，于80℃水浴中水解30 min。取出冷却后用1 mol／L  HCI调至近中性，加人1 mL  pH 6.8的磷酸缓冲液及3.5 mL乙醚，混旋、离心，将上清液转移至另一离心管中，于45℃下用空气吹干。残余物中加人50μL衍生化试剂〔MSTFA－碘代三硝基甲烷－DL-二硫苏糖醇（l 000：5：5，v／v／w）〕，于60℃下衍生化30 min，取2μL衍生液进行GC－MS／MS分析。

1．3  GC-MS／MS条件

1．3．1  色谱条件

Agilent 6890气相色谱仪，配Agilent 7683B自动进样器。Agilent HP-1毛细管柱（30 m×250 μm×0.1μm）；载气为氦气，流速1 mL／min；进样口温度250℃；吹扫时间1 min，吹扫速率60 mL／min；进样体积2μL，柱温升温程序：初始温度180℃，保持2 min，以3℃／min的速率升至224℃，再以15℃／min的速率升至300℃，保持2 min。



1．3．2  质谱条件

Quattro Micro气相色谱－串联质谱仪（美国Waters公司）。电子轰击离子源（El），轰击能量70eV，正离子化模式；离子源温度220℃，GC接口温度300℃；碰撞气为氩气，压力为47．58 Pa（3mTorr）。采用多反应监测方式（MRM），每种目标物选择1个母离子和2个子离子进行监测。分析5种内源性类固醇激素衍生物的母离子、子离子、碰撞能量和保留时间见表1。




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文章日期：2009-2-14 18:26:55
 
头发中内源性类固醇激素的GC-MS分析





摘 要：建立了建康人头发中内源性类固醇兴奋剂睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮的气相色谱-串联质谱（GC－MS／MS）分析方法。头发经碱水解后，以乙醚提取，经衍生化后采用GC－MS／MS的多反应监测模式（MRM）分析。方法的线性关系良好，检出限达0.1～0 2 pg／mg；提取回收率为74.6％～104.5％；日内测定的准确度为90.1％～113.7％，日内及日间测定的精密度均小于17.5％。应用所建立的方法测定了80例中国健康人头发中睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮的生理水平，为内源性类固醇兴奋剂滥用的判断提供了方法和基础数据。



    本文由司法部司法鉴定科学技术研究所，上海市法医学重点实验室的沈敏、向平、沈保华和王萌烨等四位研究人员做了大量头发中对合成类固醇兴奋剂检测的基础性研究实验，现将他们的论文介绍如下。



前 言

随着国际竞技体育领域反兴奋剂力度的加大和兴奋剂检测技术的发展，部分运动员更多地选择使用隐蔽性更强的内源性类固醇兴奋剂。内源性类固醇激素由人体自身分泌产生，主要包括睾酮（testosterone）、表睾酮（epitestosterone）、雄酮（androsterone）、苯胆烷醇酮（etiocholanolone）和脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）等。由于常规的尿液分析难以区分目标物内源性类固醇激素的来源，因而内源性类固醇激素检测结果的评判至今仍是兴奋剂检测中的一个难题，各国反兴奋剂研究人员试图通过多种途径寻找判定依据［1~5］。

毛发中常见滥用药物分析已有较长的研究和应用历史［6,7］，其证据性质已得到大部分国家的法庭认可。毒物分析工作者根据以往研究的积累，认为毛发分析在兴奋剂检测领域应有良好的应用前景，并试图利用毛发分析的长检测时限和反映用药史的特点来判断是单次还是长期滥用兴奋剂，以替代“飞行药检”；利用毛发中药物原体大于代谢物的特点鉴别进入体内目标物的形态（酯或衍生物），有望区分外源性和内源性物质，提供运动兴奋剂滥用的辅助证据。

本研究是毛发中合成类固醇兴奋剂检测的基础性研究工作，即建立气相色谱¨串联质谱（GC－MS／MS）分析头发中内源性类固醇睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮的方法，测定中国正常人群头发中内源性类固醇激素的水平，为内源性类固醇兴奋剂滥用的判断提供了方法和依据。



实 验

1  实验部分

1．1  药品与试剂

睾酮、表睾酮、DHEA、雄酮、苯胆烷醇酮和D3-睾酮（内标）标准品购自Cerilliant公司和国家麻醉品实验室，黑色素（melanin）和甲醇购自Sigma公司，衍生化试剂N－methyl－；N－ trimethylsilyl－trifluoroacetamide（MSTFA）和碘代三硝基甲烷购自Sigma－Aldrich公司，DL－二硫苏糖醇购自Fluca公司，其他试剂均为国产分析纯。

1．2  样品制备

头发样品采自中国健康志愿者，其中45名男性，35名女性。头发均为贴头皮采集3 cm长，并置于室温下保存。

头发样品分别用0．1％十二烷基磺酸钠（SDS）、0．1％洗洁净、丙酮振荡洗涤一次，晾干后剪成2～3 mm长度，保存供检。

称取处理的头发样品50 mg，加入100 pg  D3-睾酮（内标）、1 mL  1 mol／L Na0H溶液，于80℃水浴中水解30 min。取出冷却后用1 mol／L  HCI调至近中性，加人1 mL  pH 6.8的磷酸缓冲液及3.5 mL乙醚，混旋、离心，将上清液转移至另一离心管中，于45℃下用空气吹干。残余物中加人50μL衍生化试剂〔MSTFA－碘代三硝基甲烷－DL-二硫苏糖醇（l 000：5：5，v／v／w）〕，于60℃下衍生化30 min，取2μL衍生液进行GC－MS／MS分析。

兴奋剂类分析方法系列讲座（29）（下）头发中内源性类固醇激素的GC-MS分析

1．3  GC-MS／MS条件

1．3．1  色谱条件

Agilent 6890气相色谱仪，配Agilent 7683B自动进样器。Agilent HP-1毛细管柱（30 m×250 μm×0.1μm）；载气为氦气，流速1 mL／min；进样口温度250℃；吹扫时间1 min，吹扫速率60 mL／min；进样体积2μL，柱温升温程序：初始温度180℃，保持2 min，以3℃／min的速率升至224℃，再以15℃／min的速率升至300℃，保持2 min。



1．3．2  质谱条件

Quattro Micro气相色谱－串联质谱仪（美国Waters公司）。电子轰击离子源（El），轰击能量70eV，正离子化模式；离子源温度220℃，GC接口温度300℃；碰撞气为氩气，压力为47．58 Pa（3mTorr）。采用多反应监测方式（MRM），每种目标物选择1个母离子和2个子离子进行监测。分析5种内源性类固醇激素衍生物的母离子、子离子、碰撞能量和保留时间见表1。




1．4 方法的验证

由于正常人头发中存在内源性类固醇，以头发为基质无法进行方法的有效性验证，故本文根据头发中的药物主要与黑色素结合的机理，参照文献［8］的方法，以1 mL 1 mol／L

NaOH溶液中加人0．5 mg黑色素为基质，添加各目标物标准品进行方法学各指标的评价。
2  结果与讨论

2．1 方法的选择性

以加入0．5 mg黑色素的1 mL  1 mol／L  NaOH溶液为基质，经水解、提取、衍生化后分析，结果见图1。由图1可见基质对内源性类固醇睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮、DHEA及内标的测定无显著的影响，具有很好的特异性。




2．2  线性回归方程和检出限

在含0．5 mg黑色素的1 mL  1 mol／L  NaOH溶液中加人不同质量的睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮、DHEA标准品，配成毛发中目标物含量为0．2～200 pg／mg的样品，按照所建立的方法进行处理和分析。以目标物和内标峰面积的比值Y为纵坐标，目标物的含量X为横坐标进行线性回归，得到的线性回归方程、相关系数r、线性范围见表2。r2值均大于0.995，表明方法具有良好的线性关系。

逐渐降低添加标准品的含量，以信噪比（S／N）大于3确定方法的检出限（LOD），以S／N≥10确定方法的定量限（LOQ），结果见表2。







2．3 准确度和精密度

分别在含0．5 mg黑色素的1 mL  1 mol／L  NaOH溶液中添加不同质量的睾酮、表睾酮、DHEA、雄酮、苯胆烷醇酮，配制成高、中、低3个含量水平的质控样品。每天取各含量水平的样品6个进行测定，连续测定4 d，计算日内和日间测定的准确度及精密度，结果见表3。方法的日间及日内精密度均小于17．5％，准确度为94.8％～113.7％。



．4 提取回收率

分别对毛发中目标物含量为50，200 pg／mg的质控样品进行测定，将测定值与相同浓度未经处理的标准溶液的测定结果比较，得到睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和DHEA的提取回收率（见表4）。


2．5 样品测定

按所建立的方法对收集的头发样品进行处理与分析，结果见表5。从表5可见，所有健康志愿者头发中均可检测出睾酮和DHEA，而头发中表睾酮、雄酮和苯胆烷醇酮的含量较低，除少数几例外，大部分人的雄酮含量为0～4.9 pg／mg，苯胆烷醇酮的含量为0～2.9 pg／mg，表睾酮的含量为0～8.7 pg／mg。关于正常人头发中表睾酮、雄酮和苯胆烷醇酮的生理水平尚未见文献报道。正常人尿液中具有较高生理水平的表睾酮、雄酮和苯胆烷醇酮［5］，但在头发中出现了相反的结果，这可能与药物的化学性质有关。药物进入毛发的程度与药物的亲脂性密切相关，亲脂性强则易进人头发，而雄酮和苯胆烷醇酮是内源性类固醇代谢的最终产物，因极性较强而难以进入头发。







本文研究了80例健康中国人头发中睾酮的测定结果，与文献报道的结果进行比较（见表6）。Deveaux等［9］将100 mg头发样品碱水解后用乙酸乙酯提取，然后采用放射免疫方法分析。Scherer等［l0］采用七氟丁酸酐衍生化、Kintz等［8,11］和Wheeler等［12］采用和本研究一致的衍生化方法并进行GC-MS分析。但无论采用何种方法分析，由表6中结果可见，中国人和其他人种的头发中睾酮的含量基本上一致，均在pg／mg水平。成年男性头发中睾酮含量高于成年女性，而儿童头发中睾酮含量相对成年人则较低。



表6所列数据均为非运动员的健康人群数据，由于内源性类固醇激素可由人体自身分泌产生，不同人群和个体间存在一定的差异，因此运动员群体的睾酮水平是否在此范围内尚不清楚。根据Kintz等[13］的阳性案例报道，滥用睾酮者头发中睾酮的含量分别达46，71，54和81 pg／mg，表明两者之间还是存在显著的差异。

DHEA是另一个主要的内源性类固醇，关于健康人头发中DHEA的生理水平仅见德国［l4］和法国［8］的两篇研究报道，结果比较见表7。


Kintz等［8］曾对“本国健康人群头发中DHEA与睾酮处于同一水平”的研究结果表示吃惊和无法解释，因为血液中DHEA的含量较睾酮的含量高100～500倍，而头发中则完全不能反映这种差异。本研究所获得的结果与血液中DHEA和睾酮的含量水平的差异相一致。由于国际上对头发中DHEA生理水平的研究和报道甚少，尚不能对其合理性做出评价。本研究结果关于头发中DHEA的生理水平与睾酮有相同的性别、年龄顺序。

内源性类固醇的存在给其阳性结果的判断带来了困难。较好的方法是建立相关人群的cut-off值，将其作为阳性结果认定的阈值。但是要建立判断内源性类固醇滥用的cut-off值，尚需各国进行更大样本和更为细致的研究。



3  结语

本文所建立的GC-MS／MS方法可同时测定毛发中的睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和脱氢表雄酮等类固醇激素，其灵敏度、回收率、准确度、精密度均满足毛发中内源性类固醇激素测定的需要。

应用所建立的方法测定了80例中国健康人头发中睾酮、表睾酮、雄酮、苯胆烷醇酮和DHEA的生理水平，发现中国人和其他人种的头发中睾酮生理水平基本一致，成年男性头发中睾酮含量高于成年女性，成年人头发中睾酮含量高于儿童；中国人头发中DHEA含量远高于睾酮，与血液中DHEA的含量高于睾酮的含量的结果相一致。本研究结果为内源性类固醇兴奋剂滥用的判断提供了基础数据。

兴奋剂类分析方法系列讲座（30）海洛因依赖者尿液中部分滥用物质检测分析

海洛因依赖者尿液中部分滥用物质检测分析


摘 要 
目的：通过海洛因依赖着尿液中部分非海洛因相关滥用物质及其代谢产物、烟草相关物质及代谢产物的检测分析，了解海洛因依赖者非海洛因相关滥用物质的滥用情况，为有关部门制定相应的防治药物滥用对策提供科学依据；了解海洛因依赖者的烟草滥用状况，为有关部门制定相关的控烟对策提供科学依据。
方法：随机抽取海洛因依赖者30例，采集入院时的新鲜尿样，调pH值至5．0，用β－葡萄糖醛酸酶酶解。酶解后钠样品分别调pH值为5.0、7.0、l0.0，过Sep C18小柱，分别用2 ml甲醇、乙腈、二氯甲烷各冲洗一次，合并甲醇、乙腈、二氯甲烷冲洗液，用氮气流吹，浓缩至0．5 ml左右，采用气相-质谱联用法（GC－MS）检测滥用物质及其他成份。
结果：30例尿样中均检测出海洛因相关的滥用物质，检出非海洛因相关滥用物质15例，占50．0％。非海洛因相关滥用物质主要为巴比妥、苯丙胺类、安定等。检出烟草相关物质28例，占93．3％。
结论：⑴海洛因依赖者存在着严重的物质多重复合滥用问题。（2）海洛因依赖者中吸烟者占有相当高的比例。

    本文由宁波市微循环与莨菪类药研究所的张亚海，周文华，杨国栋等研究人员发表在《中国药物滥用防治杂志》上的论文，通过30例吸毒人员的尿中分析出来的各种毒品及其代谢物和非毒品目标物推断出一些规律性的信息。现全文介绍如下

前 言
目前，海洛因依赖者多重复合滥用问题日益突出。从本实验室连续多年对收缴的滥用物质检测发现，海洛因中往往掺入了大量的其它滥用物质[1]。明确海洛因依赖者非海洛因相关滥用物质的滥用情况，可为有关部门制定相应的防治药物滥用对策提供科学依据。同时，海洛因依赖者吸烟比例相当高，但没有一个较为准确的数据。通过海洛因依赖者尿液中烟草相关物质及其代谢产物的检测，可明确海洛因依赖者的吸烟状况，为有关部门制定相关的控烟对策提供科学依据。

实 验
1 材料与方法
1．1 仪器、试剂 
美国HP5973／6890气相-质谱联用仪；上海Sartorius BP 110S分析天平；SepC18小柱为Waters公司产品；HH－4 恒温水浴箱
由江苏金坛新一佳仪器厂生产；高纯氮气由宁波炼气厂提供：BECKMAN φ—100型酸碱度计为美国I）ECKMAN公司生产；海洛因标准品由卫生部国家麻醉品实验室提供，批号9708，纯度大于99．5％：甲基苯丙胺标准品由：卫生部国家麻醉品实验室提供，批号9401，纯度大于99，5％；β－葡萄糖醛酸酶由美国 Sigma公司提供；甲醇、乙腈为色谱纯：二氯甲烷为分析纯；其它试剂为分析纯。
1．2 对象
随机抽取2001年5月－2001年12月来本中心进行自愿戒毒治疗的海洛因依赖者30例，采集入院时的新鲜尿样。病例来自全国各地，男女比为26∶4，年龄最大为43岁，最小为24岁。
1．3 方法
I．3．1    样品提取[2]    收集海洛因依赖者入院时的新鲜尿液15 ml，离心，取上清液，用1 0 mol•L -1的盐酸调至pH值为5．0，每毫升尿液中加入0.25单位β-葡萄糖醛酸酶，37℃水浴酶解60分钟。酶解后的尿样调至pH值至5.0，过Sep C18小柱，用2ml甲醇、乙腈、二氯甲烷各冲洗一次，合并甲醇、乙腈、二氯甲烷冲洗液，用氮气流吹，浓缩至0．5ml 左右，进样检测。剩余的尿样用1.0mol•L -1的氢氧化钠溶液调pH值至7.0，过Sep C18小柱，用 2 ml甲醇、乙腈、二氯甲烷各冲洗一次，合并甲醇、乙腈、二氯甲烷冲洗液，用氮气流吹，浓缩至 0．5 ml 左右，进样检测。剩余的尿样用1 0 mol•L -1的氢氧化钠溶液调pH值至l0.0，过Sep C18小柱，用2 ml甲醇、乙腈、二氯甲烷各冲洗一次，合并甲醇、乙腈、二氯甲烷冲洗液，用氮气流吹，浓缩至0．5 ml左右，进样检测。
l．3．2  色谱条件［24］    气质联用色谱条件：进样方式为不分流进样；色谱柱HP－5MS，5．0u×30 m：载气为氦气，恒流0．8 ml•min -1：检测器为质谱检测器，温度280°C；扫描方式：Scan；溶剂延迟2min；El 源；培增电压l 800 V；检测时间40 min。检测的进样口温度为250°C，炉温为程序升温，100℃保持2 min，l0℃•min -1升至300℃，300℃保持18 min。

2 结果
30例尿样中均检测出海洛因相关的滥用物质，检出非海洛因相关滥用物质15例，占50.0％，其中检出巴比妥类6例，占20.0％：苯丙胺类及其相关代谢产物马尿酸5例，占16.7％；安定及其代谢产物去甲安定3例，占l0.0％；氯胺酮及其相关代谢产物1例，占3.3％。
30例尿样中检出烟草相关物质尼古丁及其代谢产物可铁宁28例，占93．3％。
30例尿样中还检出曲马多8例，占26.6％，对乙酰氨基酚5例，占16.7％，检出氯丙嗪1例，3.3％。

3 讨论
从几年来收缴的滥用物质检测分析结果发现，目前，我国滥用物质主要包括阿片类（如海洛因、吗啡、可待因、乙酰可待因等）、苯丙胺类（如苯丙胺、甲基苯丙胺俗称“冰”、3，⒋亚甲二氧基甲基苯丙胺俗称“摇头丸”等）、苯二氮卓类（如氯甲三唑安定即“三唑仑”、安定、艾司唑仑即“舒乐安定”、氯氮卓即“利眠宁”等）、巴比妥类（如戊巴比妥、司可巴比妥即“速可眠”、苯巴比妥、巴比妥等）等［l］。海洛因依赖者尿样检测分析结果印证了上述结果。30例尿样中均检测出海洛因相关的滥用物质，检出非海洛因相关滥用物质16例，占53．3％。非海洛因相关滥用物质主要为巴比妥、苯丙胺类、安定、氯胺酮等。说明海洛因依赖者药物滥用多重复合滥用情况相当严重。海洛因依赖者滥用物质多重复合滥用的原因可分为主动性使用和被动性使用。主动性使用主要指海洛因依赖者在滥用海洛因的过程中主动使用其它麻醉药品、精神药品及戒毒过程中使用的一些海洛因依赖者明知的各种药物。被动性使用主要是指海洛因依赖者在主动滥用海洛因过程中被动使用了其中的掺杂物以及戒毒过程中使用的一些海洛因依赖者不知情的药物。一方面，在海洛因中掺入苯二氮卓类、巴比妥类、氯胺酮等滥用物质，不仅对海洛因依赖者的身体造成严重损害，剂量过大，使用不当，往往导致滥用者意外死亡；另一方面，戒毒过程中使用的海洛因依赖者不知情的各种药物是由非正规戒毒造成的。在海洛因依赖者不知情的情况，戒毒过程中盲目地使用一些疗效不明确的戒毒药物：为改善病人的睡眠质量，盲目地使用大量精神药品（如安定、三唑仑等）；违规地使用一些有潜在成瘾性的戒毒药物（如美沙酮、曲马多、丁丙诺啡等）。上述原因造成海洛因依赖者滥用物质多重复合，对此必须给予高度关注。
海洛因在体内分解迅速，首先成为单乙酰吗啡，然后代谢成吗啡。吗啡在体内广泛被代谢，仅2％~12％无变化的吗啡自尿中排出，60％～80％以葡萄糖醛酸结合物形式自尿中排出，最重要的代谢物吗啡－3－葡萄糖醛酸。据报道吗啡的半衰期为1.7～4.5小时［5］。可待因口服后迅速吸收，首先代谢成可待因－葡萄糖醛酸结合物，l0％～15％去甲基，形成吗啡和去甲可待因，尿中可出现可待因、去甲可待因、游离吗啡和吗啡结合物[2]。
安定口服吸收迅速而完全，在体内主要被肝药酶代谢为多种活性产物，如去甲安定及去甲羟安定，它们仍然具有类似安定的药理作用。安定及其代谢产物主要由肾排泄。安定及其代谢产物血浆半衰期为1~2天［2］。
苯丙胺类在体内的清除主要通过原型排泄和生物转化两种方式。苯内胺与甲基苯丙胺服用后20分钟内在尿中出现。苯丙胺在人体的半衰期约为7~11小时，30％以原型排泄，尿pH值不同有所差异。碱性尿在24小时中排出率为45％，其中2％为原型药；而酸性尿24小时排出率约为78％，其中68％为原型药。苯丙胺可代谢成去胺基代谢物（马尿酸和苯甲酸）和羟基化代谢物。甲基苯丙胺则主要以原药被排泄出来（44％），少量（6％）变成苯丙胺，它在尿中随尿液的不同pH 有所变化，在酸性尿中未起变化的甲基苯丙胺增加[6]。
曲马多主要在肝脏代谢，通过尿液排出。口服半衰期为6小时[7]。
口服或肌注巴比妥类都易于吸收，主要自肾排泄， 部分在肝代谢。
氯胺酮主要在肝内进行生物转化成去甲氯胺酮，再逐步代谢成无活性的化合物，70％～90％的氯胺酮经脱甲基、脱氨基、羟化等酶的作用转化成苯环已酮由尿排出，仅2．5％以原形随尿排出[8~10]。

兴奋剂类分析方法系列讲座（31）液相色谱-串联质谱法鉴定 
 
液相色谱-串联质谱法鉴定

大鼠血浆中的阿托品及其代谢物



摘 要 目的：液相色谱-电喷雾离子阱串联质谱（LC –MS n）联用法鉴别大鼠血浆中的阿托品及其主要代谢物。

方法：取单剂量灌胃50 mg·kgˉ1阿托品的大鼠血样，甲醇沉淀蛋白，采用LC － MS及LC －MS n等方法分析血样。和空白血样及阿托品相比较，根据血样中代谢物相对分子质量的变化（ΔM r）及其多级质谱数据，鉴定并阐述其结构。

结果：在服药后的大鼠血样中发现5种代谢物，分别为托品、N一去甲基托品、脱水阿托品、氧化阿托品以及托品酸。

结论：该方法灵敏、快速、简便，适合于药物及其代谢物的快速鉴定。



前 言

药物代谢研究对于人们认识药物体内作用规律，指导临床合理用药以及新药设汁具有重要的意义[1]。LC-MS联用技术是现今对药物代谢研究的最有力的工具[2~4]，该方法具有灵敏度高、专属性好、样品处理简单、快速等特点，特别是多级质谱能够提供丰富的结构信息，能够在没有对照品的情况下进行代谢物的结构分析[5、6]。

阿托品（atropine）是从茄科植物颠茄（Atropabelladonna L）、曼佗罗（Datura stramonium L。）及莨菪（Hyosuamus niger L）中分离提取的一种托品烷类生物碱，有着广泛的药理活性．如解痉、麻醉、止痛等，主要用于抗休克及治疗心、肝、肺等疾病[7]，随着药理研究的进展，其用途越来越广。药用植物和药物中阿托品的含量测定［8，9］及其药动学研究已有报道［l0，11］ ，但其生物体的代谢研究很少[12]，没有对大鼠血浆中阿托品及其代谢物鉴定的报道。为全面阐明该药在生物体内的代谢过程，本文利用LC—MS n技术，对服药后的大鼠血样进行了直接定性分析，鉴定出了原药及其5种代谢物。



本文是湖北省杰出青年基金和湖北省中药生物技术重点实验室开放基金项目的部分内容，由陈怀侠l，2、杜鹏1、韩凤梅l、陈勇1（l，湖北大学中药生物技术省重点实验室；2．武汉大学化学与分子科学学院）等共同完成对阿托品的五种代谢物的研究，现全文介绍如下：



实 验

1 仪器与试剂

美国Finnigan公司LCQ离子阱型质谱仪，包括ESI（电喷雾电离）源，TSP P4000泵及TSPAS3000自动进样器；Highchem公司Mass Fronter

1．2质谱解析软件。

阿托品（美国Sigma公司）。甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。



2 实验方法

2．1 阿托品对照品溶液

取阿托品对照品适量，以甲醇配制成浓度为1．0 mg·mL- l的储备溶液，再用流动相适当稀释后进行LC－ MSn分析。

2．2 生物样品的处理

6只健康Wister大鼠（200±10）g，购于湖北省实验动物研究中心，合格证：SCXK（鄂）2003 －2005。大鼠禁食12 h，按50 mg·kg- 1灌胃给药阿托品后，分别于5，45 min及2，18，24 h眼眶取血，肝素抗凝，5000 r·min -1离心l0min，上清液置于一70℃冰箱中保存备用。取各时间点的血浆，加3倍量甲醇沉淀蛋白，5000 r·min -1离心10 min，上清液过0.45μm微孔滤膜，滤液用于HPLC － MSn分析。

2．3 测定条件

2．3．1 色谱条件

Agilent Zorbax extend C18不锈钢色谱柱（3．0 mm×100 mm，3．5 μm），同种填料的色谱保护柱（2．1 mm×12．5 mm，5 μm，Agilent），流动相：甲醇:2 mmol·L－1醋酸铵水溶液（以甲酸调节pH 3．5）（70：30），流速0．2 mL·min -1，柱温40℃，进样量20μL。

2．3．2 质谱条件

ESI离子源，扫描范围：m／z 100～1000，离子源喷射电压4．5 kV，毛细管电压21 V，毛细管温度175℃，鞘气（N2）流速：40个单位。自动进样器直接进样，正、负离子方式检测；采用全扫描一级质谱（Full scan MS）及其源内碰撞诱导解离（S － CID）、全扫描二级质谱（Full scan MS2）及三级质谱（Full scan MS3）等方式进行测定。



3 结果与讨论

3．1 阿托品的LC － MS（MSn）分析

阿托品的一级质谱以分子离子峰m／z 290［M＋H］＋为基峰，没有聚合及其他加合现象（图1－A）。为进一步了解其二级质谱裂解规律，本文采用离子阱技术对阿托品的准分子离子，m／z 290进行多级质谱分析，其二级质谱（相对碰撞能量为30％）及其LC－ MS2全扫描色谱见图1 －B、C。由图1 －B可见，阿托品的分子离子失去一分子水产生碎片m／z 272［M＋H － H20］＋，而分子离子失去一分子甲醛产生碎片m／z 260［M＋H － HCH0］＋。其二级质谱中丰度最高的碎片m／z 124是其母分子离子失去托品酸（C9H10O3，相对分子质量Mr＝166）产生的。该碎片离子rn／z 124失去NH2CH3（Mr＝31）产生碎片离子m／z 93。而其二级碎片m／z 272和260的三级质谱中均出现m／z 124，93，91，由此说明，m／z 124，93，91是阿托品分子离子的特征子离子，Mr＝30和Mr＝166是其特征中性碎片丢失。这种特征子离子和特征中性碎片丢失是阿托品生物体内代谢物鉴定的依据。