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主题：【资料】兴奋剂类分析方法系列讲座(40讲待续)

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2011/7/20 16:53:01 71楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（42讲）HPLC同时直接进样测尿中咖啡因5种代谢物

摘要

目的：为保证应用咖啡因代谢探针的正确性，建立了反相高效液相色谱测定尿中咖啡因代谢物的方法。

方法：采用Shim-pack VP － COD柱（4.6 mm×150 mm×5μm）、岛津Shim-pack C₁₈预柱、流动相为乙睛－ 0.05％醋酸、0～24 min时0.05％醋酸的量从2.5％线性增加至8％，流速为1 mL·minˉ¹，柱温25℃，检测波长为280nm。

结果：咖啡因5种代谢物均能良好分离，在所考察的范围内有良好的线性，r为0.9998～0.9999，平均回收率95.59％～102.2％，日内和日间误差均小于3％。

结论：本方法简便、准确、快速，适合于尿中咖啡因代谢物的测定及N一乙酰基转移酶、细胞色素P450酶 I A2和黄嘌呤氧化酶等药物代谢酶活性的研究。

本文由李军①、彭向前②和张鉴①合作完成（①山东省立医院临床药理中心、②山东大学药学院），重点介绍11种代谢物中的5种，现全文介绍如下。

前言

人体摄入的咖啡因几乎全部经过肝脏代谢，许多酶竞争性地参与其代谢过程，其中N-乙酰基转移酶（polymorphic N -acetyltransferase，NAT2）、细胞色素P450酶1A2（cytochrome P450 lA2，CYPlA2）和黄嘌呤氧化酶（xanthine。xidase，X0）起着主要作用。咖啡因由于其安全性，已成为一种用于测定NAT2、CYPlA2和X0活性的有效的探针药物^［¹^］。咖啡因在体内能产生多达13种水溶性较强的代谢物，因此建立一套可靠而简便的咖啡因代谢物色谱测定方法成为整个代谢酶研究的关键。

本方法主要测定咖啡因 5种主要代谢产物，可以采取不同的代谢物比率及组合反映NAT2、CYP1A2和X0这3种酶在体内的活性，用于临床药理特别是遗传药理学的研究。5-乙酰氨基-6-甲酰氨基-3-甲基尿酸（AFMU）的形成与NAT2的活性成正比，慢代谢者AFMU形成少，而快代谢者AFMU形成多，但三者［AFMU、I －甲基黄嘌呤（1X）、l－甲基尿酸（I U）］的总量却没有明显变化，用AFMU量与（AFMU＋I X＋I U）总景的比值就可以反映NAT2的活性；咖啡因的主要代谢产物1，7 -二甲基黄嘌呤（17X），其7位去甲基化反应仅由CYPlA2催化，尿中（AFMU＋1X十1 U）总量受CYPI A2活性的影响，所以（AFMU＋1 X＋1U）总量与17X 量的比值可以反映CYPlA2的活性；1X是X0的良好底物，X0催化1X生成1U，因此用1U量与（1 X＋lU）量的比值反映X0的活性^［²^］。

传统的咖啡因代谢物定量方法主要采用提取的方法用H PLC进行测定，不仅方法烦琐，而且对提取过程中的操作要求较高，定量的准确性难以得到保证。本文采用梯度洗脱的方法同时直接测定人尿中咖啡因5种主要代谢物的含量，不需提取，直接将尿样进入HPLC系统，不仅简便了方法，同时也提高了检测的准确度。

实验

1 仪器与试药

日本Shimadzu-10Avp型高效液相色谱仪；雀巢咖啡，东党雀巢有限公司；AFMU，加拿大多伦多大学药理系提供：1 X、1 U、17X、1，7-二甲基尿酸（17U）均购自Sigma公司；醋酸、乙腈均为色谱纯，实验用水为重蒸去离子水。

2 色谱条件

SCL-10AYP中央控制器，LC-10ATVP高压泵，SIL- l0ADVP自动进样器，SPD-10AVP紫外可见检测器，CLASS-VP5.0色谱数据工作站（日本Shimadzu公司）：岛津Shim-pack VP － COD柱（4.6mm×l50 mm×5μm）；岛津Shim-pack C18预柱；流动相为乙腈－0.05％醋酸，0～24 min时0.05％醋酸的量从2.5％线性增加至8％；流速为1 mL·minˉ¹；柱温25℃；检测波长为280 nm；进样体积：20μL。

3 实验方法与结果

3．1 对照品溶液的制备

分别精密称取AFMU、1U、1 X、17U和17X对照品适量，用水制成20μg·mLˉ¹对照品溶液。

3．2 线性关系

精密量取AFMU、I U、I X、17U和17X对照品溶液，用空白尿分别稀释成浓度为0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，12.0，16.0μg·mLˉ¹的标准工作液，按上述色谱条件分别进样，测定峰面积。以浓度X（μg·mLˉ¹）对峰面积y作线性回归，得标准曲线。AFMU、1 U、1 X、17U和17X标准曲线回归方程分别为：

y＝1.386×10⁶X＋6.300×10⁴ r＝0．9999（n＝5）

y＝1.842×10⁵ X＋622.0 r＝0．9999（n＝5）

y＝6.879×10⁴ X－404.8 r＝0，9998（n＝5）

y＝1.1 13×10⁵X3.579×10³ r＝0．9999（n＝5）

y＝8.014×10⁴X－1.130×10³ r＝0．9998（n＝5）

结果表明，AFMU、1U、1X、17U和17X在0.5～16.0μg·mLˉ¹浓度范围内线性关系良好。

3．3 最低检测限

在上述色谱条件下，当信噪比为3：1时对最低检测限进行测定。结果表明，AFMU、1U、lX、17U和17X的最低检测限分别为0.20，0.05，0.12，0.05，0.05μg·mLˉ¹。

3．4 样品收集及处理

受试者在取样前3 d内禁用含咖啡因的食物和饮料。实验当天早上9：00口服1标准杯咖啡（每杯加咖啡因120 mg和咖啡3 g，共含咖啡因约215 mg），下午14：00留取尿样10 mL至加人维生素C 200 mg的样品瓶中，于一20℃保存直至分析。取尿样500μL置1 mL带塞离心管中，10000 r·minˉ¹离心5 min，取上清液，按上述色谱条件直接进样20μL。

3．5 咖啡因5种代谢物的分离情况

表1列出了咖啡因5种代谢物的保留时间。在上述色谱条件下咖啡因5种代谢物之间具有良好的分离度（色谱图1 －A）；从受试者尿样色谱图（色谱图1 －C）可以看到在AFMU、lU、1X、17U和17X峰位上没有尿中杂质干扰，而且代谢物与杂质的分离度较好。

图-1 高效液相色谱图

A 咖啡因5种代谢物标准工作液 B 空白尿样 C 受试者尿样

1. AFMU 2. 1U 3. 1X 4. 17U 5. 17X

3．6 回收率及精密度试验

取线性关系项下配制的高、中、低3种浓度（12.0，8.0，2.0μg·mLˉ¹）的标准工作液，按样品收集与处理项下操作，进样分析，测定值与相同浓度对照品溶液进样测定值之比计算方法回收率（n＝5）；同日和连续5 d各处理5份标准工作液，求得其日内RSD和日间RSD。结果AFMU、1U、1X、17U、17X的平均回收率分别为97.89％，99.89％，100.0％，102.2％，95.59％；日内RSD分别：为3.5％，3.2％，2.3％，2.0％，2.6％；日间RSD分别为3.9％，3.1％，2.2％，2.1％，2.5％。5种代谢物回收率均在95％以上，日内和日间误差均小于4％。

4 讨论

4．1 咖啡因5种代谢物水溶性较大，常规提取方法提取率不高，本方法集样品的前处理、分离及分析测定于一体，大大简化了操作步骤，缩短了分析时间，避免了传统HPLC方法样品前处理过程引人的误差；采用有机相递增梯度洗脱，大大缩短了保留时间，改善了物质的峰形和测定精度。

4．2 尿样直接进入对于预柱及分析柱的寿命有一定的影响，因此我们在AFMU出峰后又延长了流动相冲洗的时间，同时加大了乙腈的比例，使尿中的杂质得到进一步清除；同时在每批样品进样完毕后，先用乙腈-水（25:75）冲洗预柱和分析柱1 h，最后以乙腈一水（75:25）冲洗30 min。

4．3 AFMU的性质不稳定，尤其是在碱性条件下易转变为5-乙酰氨基-6 -氨基-3-甲基尿嘧啶（5- acetylamino - 6 - amino -3 - methyluracil，AAMU），因此尿样保存时必须用维生素C调为酸性^［³^］，尿样处理时尽量在低温下操作，并尽量缩短处理时间。

4．4 为保持良好的分析效果，在分析30次尿样后，要用乙腈冲洗色谱柱30 min，并在下一次进样前用流动相冲洗1 h。

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2011/7/20 16:57:14 72楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（43讲）用硅藻土提取肝脏中安定的方法研究

摘要：目的建立以亲水性固相材料硅藻土为支持物分离提取肝中安定。方法取1.0g 肝匀浆用6%高氯酸沉淀蛋白，离心，取上清液加入硅藻土柱中，用二氯甲烷洗脱。洗脱液50℃水浴挥干后，用4.0ml1.0mol / L 的盐酸溶解，测定其紫外二阶导数光谱。结果提取率达91.0%，变异系数2.5%，检出限0.25μg /g，线性范围0.5—5.0μg / mL。结论该方法操作简单、实用，杂质含量低，可以作为法医毒物分析的常规方法。

本文由中国刑警学院法医系吴玉红和夏俊教授共同使用紫外二阶导数光谱法（紫外可见分光光度计）分析人体肝中的安定方法，肝的前处理比较复杂，本文的前处理也可用于气相色谱分析，现全文介绍供网友们参考。

前言

安定属苯并二氮杂卓类安眠药，广泛应用于临床，具有安眠、抗焦虑、抗癫痫等作用。其副作用常有成瘾滥用、服用过量中毒或死亡等。有的犯罪分子用该药将人麻醉后进行抢劫犯罪等，因此该类药品是司法检验常见药物之一。目前从生物检材中分离提取安定，已有液液萃取、GDX 固相萃取［1］等报道。对于液液萃取法，提取液的杂质含量高，提取率相对较低，容易产生乳化现象。GDX 固相萃取克服了液液萃取法的上述缺点，但GDX 萃取操作复杂、费时。本研究选用硅藻土分离提取肝中安定的方法，除具有GDC 固相萃取的优点外，还具有操作更为简便、实用、快捷等优点，同时与紫外二阶导数光谱法结合使用能有效消除杂质干扰，报道如下：

实验

1 实验部分

1.1 材料及试剂

日本岛津UV-250 型紫外可见分光光度计；硅藻土（Celite）载体545（上海化学试剂采购供应站进口分装）；肝：符合卫生标准的市售新鲜猪肝，制成匀浆，于- 4℃冰箱中冷冻备用；安定；纯品，质量符合中国药典规定。用甲醇配制成1.0mg / ml 的标准储备液；乙醚、甲醇、二氯甲烷、盐酸、高氯酸均为分析纯。

1.2 实验方法

取1.0g 肝匀浆加入10ml 的具塞试管中，加入浓度为6%高氯酸6.0ml，涡旋、离心，分取1 / 4 上清液于装有5ml 硅藻土的层析柱中（5ml 医用注射器，下端注射口处塞有少许脱脂棉），待上清液全部渗入硅藻土后，加二氯甲烷进行洗脱，收集8ml 洗脱液于洁净的小烧杯中，水浴50℃ 挥干，然后用4.0ml 1.0mol / L 的盐酸溶解，测定所得溶液的二阶导数光谱（测定条件：石英吸收池厚1.0cm，波长范围220—280nm，标尺± 0.04，参比液1.0mol / L 的盐酸溶液Δλ= 2nm）。根据安定光谱图查出242nm 负峰与249nm 峰吸光度二阶导数差值，由标准曲线计算安定含量（根据所取上清液占全部上清液体积进行折算）。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的制备

分别取1.0mg / ml 的安定甲醇标准溶液0，2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0μl 置于小烧杯中，室温下挥干后，用1.0mol / L 的盐酸4.0ml 溶解，配成浓度分别为0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg / ml 的系列标准溶液。测定各溶液的二阶导数光谱图，从图3 中查出242nm 负峰与249nm 峰吸光度二阶导数差值Y，以Y（cm）为纵坐标，浓度X（μg / ml）为横坐标作图，得一直线。线性范围为0.5 ～ 5.0μg / ml，线性方程为Y =3.39X + 0.08，r = 0.999

2.2 萃取条件的确定

2.2.1 硅藻土用量及上清液用量的考查

根据硅藻土提取原理为分配原理，硅藻土用量与上清液量需匹配。若将沉淀蛋白后的全部上清液完全倾入层析柱中，硅藻土的用量至少为10g，实验成本高，且洗脱剂用量也要加大，挥干也费时，体现不出此方法的优点。经对添加安定的肝检材进行实验，以每份上清液的1 / 4 过柱，提取率经折算（4 倍），只需2.3g 硅藻土，且提取率很高。因此选择1 / 4 上清液过2.3g 硅藻土。

2.2.2 洗脱剂种类考查

笔者进行了二氯甲烷和乙醚两种不同的洗脱溶剂对肝中添加安定及空白肝检材的背景实验。结果发现：乙醚作洗脱剂时，洗脱液杂质较多，背景很差；用二氯甲烷作为洗脱剂时，洗脱液杂质少，提取率很高，同时二氯甲烷沸点较低，易于挥干，使操作简便。因此，本研究采用二氯甲烷作为洗脱溶剂。

2.2.3 洗脱剂用量考查

在二氯甲烷的用量考查上，先收集4ml 洗脱液，后以2ml 二氯甲烷为单位，连续收集4 份，进行测定。结果发现收集量在8ml 以后，洗脱液中不含药物。因此，收集8ml 二氯甲烷即可。

2.2.4 pH值对萃取的影响

安定属于碱性药物，依据萃取原理，在碱性条件下有较高的提取率。笔者考察了不同pH 值条件下安定的提取率。用6%高氯酸沉淀蛋白质后的上清液直接过柱、或用浓氢氧化钠（10mol / L）调至pH7、pH9、pH11 后过柱，实验发现：安定在上述4 种条件下，提取率未见明显改变。且调节pH 值后，溶液变得粘稠，使操作繁琐、不便，而且使检液体积增大，相应需增加硅藻土用量。因此，本方法中没有调节pH 值。

2.2.5 沉淀蛋白试剂高氯酸浓度的考查

分别用2%、4%、6%、8%、10%、12%不同浓度的高氯酸按本文方法实验。结果发现：以6%的高氯酸沉淀蛋白质的提取率为最高；高氯酸浓度大于或小于6%时，提取率都呈下降趋势。所以本研究选用6%的高氯酸沉淀蛋白质。

2.3 紫外光谱的考察

由空白肝制得测定液的光谱，相当于含药物肝检材制得的测定液中杂质的光谱。图1、2、3 可见，杂质对安定的普通紫外光谱测定有一定的干扰，但对二阶导数光谱测定法几乎无干扰。

2.4 提取率和精密度

取1.0g 空白肝匀浆5 份，分别添加10.0μg 安定，按本文方法提取、测定，结果平均提取率91.0% ±2.5%。

2.5 检出限和定量限

取空白肝匀浆5 份，按本文方法提取、测定，以该测值标准差的3 倍计，得出安定的检出限0.25μg /g；以该标准差的10 倍计，得出安定的定量限0.82μg / g。

全文完

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2011/7/20 17:06:39 73楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（44讲）

纳曲酮冲击疗法与全麻快速脱毒临床比较分析

摘要

目的:比较纳曲酮冲击疗法(冲击组)与全麻快速脱毒法(全麻组)的优劣。

方法:40例海洛因依赖者进行纳曲酮冲击治疗，10例进行全麻快速脱毒。

结果:冲击组均在病房内进行;治疗中P个、Rf、Bp t，但均能平顺度过，次日服纳曲酮无明显戒断症状，冲击成功率100%;治疗后1-4天戒断症状、不良反应均明显低于全麻组;治疗前后血常规、心电图、肝功能、肾功能无明显改变;半年操守率达30%。全麻组均在手术室且需行气管插管方可完成;10例中有1例发生吸入性肺炎;仅1例保持3个月未复吸。结论:纳曲酮冲击疗法具有设施设备要求不高，冲击成功率高，治疗后戒断症状、不良反应轻，安全性高，依从性好，可弥补全麻快速脱毒之不足，有较好地防复吸效能，有临床实用价值。

本文由湖南省脑科医院，湖南省自愿戒毒中心主任医师王文甫，刘国阳，陈辞珍等共同完成，摘自《中国药物滥用防治杂志》第十二卷第六期P341~344

作者王文甫男，主任医师，兼职教授主任，主要从事药物依赖的研究

前言

目前，对海洛因依赖急性脱毒方法较多，脱毒成功率均可，但一般脱毒治疗后复吸率高达95%以上[l]，临床上发现，复吸率最高的是脱毒后三个月之内，称之为复吸的高危期。为了减少复吸，脱毒治疗后服用纳曲酮(NTX)有肯定防复吸治疗作用[2-4]。使用NTX抗复吸治疗方法有常规使用法[5]，全麻快速脱毒法调及著者探索的NTX冲击疗法[9]。常规法使用NTX住院时间长，患者因种种原因无法住够疗程而出院复吸。全麻快速脱毒及NTX冲击治疗均能较快进入抗复吸治疗，各有何优点，抗复吸效果如何，其安全性、依从性如何，很有必要对两者进行比较分析，供同道们参考。

实验

1、资料和方法

1.1 全麻快速脱毒法(UROD)

1.1.1 一般资料:

本资料为2002年~2003年住院自愿戒毒病人，符合CCMD-Ⅱ-R海洛因依赖诊断标准，共10例，全部为男性，年龄平均为29.8士1.6岁，滥用史6.7士1.9年，日滥用量1.4士0.4克，静脉注射9例，烫吸1例。

1.1.2 术前准备:

患者入院后签署UROD知清同意书:检查血常规、肝功能、肾功能、血糖、血清电解质、心电图、胸透;禁食、禁水8^10 h，灌肠;可乐定4μg/ kg， Ranitidine 0 .1g im；Atropine 0.5 mg或Hyoscine 0.3 mg im; NTX 50mg, Midazolom 5 mg im;监测ECG、BP、HR、SO₂_、 PET CO₂打通静脉通道。麻醉:异丙酚2.2~5 mg/kg，维库澳胺0.1 mg/kg ，气管插管，机控呼吸，留置胃管，气囊导尿管。维持麻醉用异丙酚，异氟醚，咪唑安定等维持5-6小时。输入平衡液2 500~3 000 ml。氟呱利多加强镇静作用，期间NTX 50 mg置留胃管内。复苏:下呼吸机，置麻醉监护室观察24小时，清醒后拔出胃管及导尿袋。送回戒毒科，以后每天服NTX 40 mg.

1.2 NTX冲击方法

1.2.1 一般资料:

本组资料为2003年12月一2004年9月住院戒毒病人，符合CCMD-II -R 海洛因依赖诊断标准。同意该法治疗并签署NTX冲击疗法知情同意书，体格检查及实验检查排除躯体并发症、传染病和神经、精神疾病。

1.2.2 入院后先常规脱毒

6-8天后，第1-3天使用美沙酮，后改丁丙诺啡脱毒治疗，轻度吸毒者，入院时即开始使用丁丙诺啡脱毒治疗。

1.2.3 冲击方法:

术前准备，进行血常规，心电图，肝功能，肾功能，胸透检查无明显异常，术后次日复查。禁食8小时，排空大小便，尿吗啡定性检查，冲击治疗:心电监护，由专人看管，记录治疗期间P、 R、BP、SO2及呕吐，哈欠，腹泻，瞳孔，肢动，躁动，惊起等情况，每小时一次，心电监护7小时，用药:口服可乐定4μg/ kg，氟呱啶醇(Haldol) 10 mg im 。莨菪类:长托宁1 mg，东莨菪碱0.02 mg-/kg .氯丙嗪1~1.5 mg/kg ，安定10~30 mg,，NTX 50 mg，口服，病人用药后很快入睡。对症处理:加强镇静可用氯硝西泮、咪唑安定，心率持续超过150次/min者给美托洛尔5mg，术中病人仰卧，头偏向一侧，男性接囊性导尿袋，睡眠过深舌后坠明显者插口咽通道管，定期翻身防褥疮。术后观察，服NTX情况，戒断症状及药物副反应情况。冲击治疗成功标准:冲击治疗平顺度过，次日服NTX 40 mg后无明显戒断症状。

1.3 各量表评定

1.3.1 戒断症状量表评定:

两组病人术后均进行戒断症状量表评定，按北京医科大学中国药物依赖性研究所的方法评定，共20项，由专人每天上午评定头一天内出现的戒断症状。每项指标评分:0分，无症状；1分，症状轻微；2分，主动诉述，可忍受；3分，症状明显难以忍受。症状包括:渴求，焦虑，激动不安，呕吐，发热面孔，畏寒，哈欠，流涕出汗，困倦，起鸡皮，震颤，骨肌肉疼痛，恶心，厌食，腹泻，失眠，卷曲姿势。

1.3.2 药物副反应量表评定:

项目包括头晕，头痛，嗜睡，周身无力，视物模糊，步态不稳，口干，恶心，呕吐，厌食，便秘，腹痛，腹泻，皮疹，睡眠障碍，骨关节疼痛，易激惹，胸闷发慌，紧张，焦虑共20项。评定方法及程度同上。

1.4 总体疗效评定

由医师及病人对相应疗法总体疗效分别进行评定。

1.5 随访

对两组病人出院后进行半年随访，比较两组操守率。随访以电话随访，来院门诊，购NTX，免费进行尿吗啡定性检查为依据。

1.6 质量保证先集中学习，统一评分标准，由专业人员进行量表评定。

1.7 统计学处理所有资料用SPSS 10统计软件包进行统计分析，计量资料采用t检验，计数资料用X²检验。

2 结果

2.1 一般资料全麻组:

共10例，均为男性，年龄平均29.8士1.6岁，滥用史6.7士1.9年，末周平均日用量1.4士0.4克，滥用方式，静脉注射9例，烫吸1例。冲击治疗组:共40例，均为男性，年龄平均30.1士4.2岁，滥用史5.1士2.3岁，末周平均日用量0.96士0.19克，滥用方式，静脉注射37.例，烫吸3例。

2.2 治疗期间情况

全麻组:均完成UROD，术中呼吸22~36次/分，心率110~135次/ min，初2小时内不稳定，多有肢动，6例术中及术后出现腹泻便床，5例在下机时出现呕吐，胃液量800~6 000 ml，尿液1000~1 500 ml， 1例在复苏时出现剧烈呕吐，导致吸入性肺炎。经积极抗炎，激素，对症处理而痊愈。1例出现全身广泛性皮疹，经抗过敏治疗而愈，该2例术后未使用NTX.冲击组:入院至冲击治疗时间平均6.35士1.21天，尿吗啡定性检查阴性37例，阳性3例。治疗期间体温无变化，无腹泻，便床，血氧饱和度变化小，平均97%,瞳孔大多无变化，有3例变大，2例变小，P、R、BP变化大的均在第一小时开始出现变化，其中P、 BP以第2~4小时为高峰，以后开始下降，而R则在第3~6小时均为高峰，P最快达170次/min，用美托洛尔5 mg后会很快减至150次/mm，以内。R增快较明显，且持续时间长，最快达60次/min。27例术中出现肢动，其中8例出现躁动不安，5例出现惊起，经加强镇静药后会很快安静下来，少数肢动可持续4小时，脱毒治疗后使用丁丙诺啡时间长者，治疗中反应轻。

2.3 术后戒断症状及不良反应比较

全麻组术后戒断症状及不良反应均明显重于NTX冲击治疗组，均具统计学差异，见表1，术后每天9 Am评定一次戒断症状及不良反应，至出院时止。

从表 1可以看出，全麻组术后戒断症状、不良反应均比NTX冲击治疗组重，且持续时间长。而NTX冲击治疗组戒断症状不良反应轻，且消除也快，平均住院2.5天即出院。

2.4 两组术后有关情况比较

两组脱毒成功率均中国药物滥用防治杂志2006年第12卷第6期达100%，全麻组术后2例未能使用NTX，余均于次日服用NTX 40 mg，全麻组戒断症状明显者给丁丙诺啡治疗，冲击治疗组戒断症状不明显。冲击治疗组治疗时睡眠时间平均9.69小时，清醒后无意识障碍，不良反应有口齿不清、不思饮食、视物模糊、乏力，术后血常规、肝功能、肾功能、心电图与术前比较无明显异常。

2.5 总体疗效比较

由医师、病人分别进行评定，见表2一表5

2.6 随访

随访时间半年，日期从出院算起，方式以电话，门诊，购服NTX，免费进行尿检，两

组操守情况详见表6

3、讨论

从本研究可知，全麻快速脱毒尽管可快速进入NTX抗复吸治疗，但存在以下不足:

(1)设施设备要求高:要求患者必须在手术室内完成，需专业麻醉科医师，要进行气管插管，持续全身麻醉，置留胃管、导尿管，心电监护，术后还需在麻醉监护室内观察24小时，以防意外。冲击疗法则可在戒毒病房内完成，只需一台心电监护仪。

(2)全麻脱毒术中反应大:患者除机械通气外，还需置留胃管，引流胃液多，腹泻发生率高，全麻10例中即有1例出现吸入性肺炎。而冲击治疗组没有腹泻，出现呕吐也是在清醒后发生，没有吸入性肺炎发生。

全麻术后戒断症状及不良反应大，持续时间长，而冲击治疗术后戒断症状及不良反应均明显轻于全麻组，恢复快，时间短，术后至出院时间平均2.5天。

(3)全麻组病人依从性差:从医师对两组病人疗效评定病人可接受性看，冲击治疗病人可接受性好和较好均明显高于全麻组，在治疗中也发现，10例全麻病人复吸再住院，均拒绝再做该项治疗，而冲击治疗组中复吸者要求再次做该法者多见，甚至有一例已进行四次冲击治疗。

(4)全麻复吸率高:10例全麻戒毒中只1例维持3个月未复吸，而冲击治疗第一个月操守率达80%，当然影响复吸因素很多，其中全麻组例数太小也可能有一定关系。

目前，戒毒方法很多，从戒毒模式上有强制戒毒和自愿戒毒，在脱毒治疗方法上以药物为主，但一般脱毒复吸率极高，达95%以上。我院在戒毒方法上进行过很多探索，血液净化脱毒效果不佳[10]，全麻脱毒存在诸多不足[s1，中药戒毒，从急性脱毒效果看，仅能与单纯可乐定相比，有肯定防复吸效果的还是NTX抗复吸治疗。使用NTX抗复吸治疗有两种模式，一是常规方法使用，但时间长，患者因种种原因难以住够疗程而提前出院复吸，呈现要求使用NTX者多，而实际应用者少。快速进入抗复吸治疗的有全麻快速脱毒，但因存在种种不足，我中心探索的NTX冲击疗法脱毒，快速进入抗复吸治疗的研究具有设施设备要求不高，术后戒断症状、不良反应轻，安全性高，依从性好等优点，与常规服用NTX抗复吸比较[11]没有显著差异，故认为是目前较好的一种快速脱毒进入抗复吸治疗的方法，可在临床推广应用。

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（45讲）我们如何才能拒绝间接毒品的伤害

《广州日报》登载了一篇文章，题目是《我不想把命都赔在喝止咳露上》。文章说的是一个21岁的林仔近日主动致电广州日报求助，希望找到戒绝酗饮止咳露恶习的办法。林仔向记者哭诉，两年前，去酒吧玩，在朋友怂恿下一口气喝下一整瓶止咳露，从此被毒魔缠上，如今已发展到每天非喝四五瓶否则难抵毒瘾的地步，为此，他身体孱弱，陷入了无法正常工作不能养活自己的绝境，绝境之中，他痛下戒瘾决心，却苦无门路。

　　林仔还告诉记者，他身边几个最好的朋友因喝止咳露上瘾而越喝瘾越大，到后来一次喝五六瓶都不顶瘾了就干脆吸起白粉来。吸白粉要钱，他们没有，就去抢劫，或者做下线帮忙出粉，现在，一个接一个都关进去了。“我现在已经活得不像人样了，我不想日子再往坏处走，我很怕，很怕有朝一日会像他们一样，落得吸毒或者坐牢的下场。”

　　联邦止咳露为何药？联邦止咳露中主要成分磷酸可待因是一种中枢性镇咳药，具有较强大的镇咳和镇痛功能，其作用强度为吗啡的四分之一，能起到兴奋呼吸中枢神经的作用，大量服用会产生快感和幻觉，出现晕眩、心跳过速等不良反应，长期饮用会上瘾，如果一次服用可待因800毫克以上，极可能导致死亡，故此，1998年5月，卫生部将联邦止咳露、佩夫人止咳露等含有可待因的药物列入处方药管理，零售药店必须凭医生处方销售。

　　联邦止咳露既然是处方药，必须要凭医生处方才能在药店买到，但是广州日报的记者于近日对位于越秀区、天河区、白云区的20家药店进行了随机调查，发现虽然大多数规模较大或者品牌信誉良好的药店都没有出现违规销售联邦止咳露的情况，但在一些规模较小的药店，还是能够轻易买到这种药，而且“不需处方，买多少有多少”！

　　我们说药品是可以为病人解除病痛的，人们得了病不吃药不行，然而问题是药品的另一方面的副作用却是人们不知道的。我们现在知道了联邦止咳露是有副作用的，但还有多少类似联邦止咳露的药有副作用我们是不知道的呢。从目前整个社会状况来看，应该说大多数消费者是没有任何医学常识的，那么这些消费者究竟如何才能防止药品的副作用给人们带来伤害呢，换句话说，人们如何才能拒绝间接渠道的毒品给人们带来的伤害呢，事实上这是让大多少消费者无法解决的问题：一方面社会上不良商家唯利是图，他们根本不顾消费者的利益，把需要医生处方的药与不需医生处方的药混为一起，让消费者随意买取自己需要的药品；另一方面医院各种不合理的收费迫使消费者自行到药店购买所需的药品。如此一来，消费者拒绝间接毒品对人身体的侵害是在所难免的。

　　毒品对人的身体、对一个家庭带来的伤害是大家有目共睹的，谁也不会愿意自觉地接受毒品，但，消费者在被动地、不知情地情况下接受了毒品，你又能怎样呢？你又能找谁去跟你负责呢？你又能找谁去理论呢？广东省第二人民医院成瘾医学科何日辉医师表示，他们医院在近7个月内已经收治了80名类似的患者，其中最严重患者一天要豪饮13瓶止咳露！由此我们看到，像类似这样服用药品给人带来副作用的情况我想全国各地应该还有。

　　那么我们究竟怎样做才能拒绝间接毒品对我们造成的伤害呢？

（全文完）

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（46讲）蛋白沉淀-高效液相色谱法筛查血浆中61种常见的中枢神经系统药物

摘要：建立了利用蛋白沉淀提取血浆中61种常见的中枢神经系统药物，并用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC．DAD)分析的方法。1 mL血浆样品中加入1．5 mL乙腈，旋涡混合后，离心，上清液过滤后直接采用HPLC测定。选用Agflent TC—C18色谱柱(250 mm×4．6 mm，5μm)，以磷酸盐缓冲液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，流速1．5 mL／min，柱温35℃，检测波长210 nm。61种药物的回收率均大于80％，相对标准偏差为0.94％一11.23%。采用乙腈沉淀蛋白，方法简便、快速、回收率高且稳定，能够作为系统毒物分析的通用前处理方法。该蛋白沉淀方法与HPLC·DAD技术结合，可应用于61种药物的分析。

作者：福建医科大学第二临床医学院药剂科的张吟、陈一农；福建医科大学药学院药理学系的张吟、陈崇宏；福建医科大学第二临床医学院免疫内科的林玲共同协作完成福建省卫生厅青年课题和泉州市科技局课题内容。

通讯联系人：陈崇宏，教授．Email：chench2008@163．com．摘自《色谱》第二十七卷第六期p787~793

前言

系统毒物分析(STA)是指针对未知存在和未知性质的毒药物进行的分析，它是旨在检测并鉴定生物体液中未知化合物的一种系统分析方法[1]。样品预处理是系统分析的关键技术之一，STA要求所采用的预处理方法必须尽可能多的对毒药物进行定量回收，并且必须是通用方法。目前报道的血浆样品的预处理方法有液-液萃取[2]、固相萃取阻[3~5]等。液-液萃取必须在合适的pH条件下才能进行，酸性药物需要在酸性环境中萃取，而碱性药物则需要在碱性环境中才能进行，因此不同的药物需要调节不同的pH值，这就限制了其作为STA通用样品前处理方法。尽管各种机制的固相萃取方法被作为STA的样品前处理程序，然而，由于其可能遗漏某类或某些回收不好的药物，当其作为筛选方法时，还需要其他方法来加以补充[6,7]。蛋白沉淀是一种传统的方法，被广泛用于血浆样品的前处理，但是目前已报道的蛋白沉淀方法大多只涉及几种或某一类药物的分析[8~11]，且用于系统分析者未见报道。本研究采用乙腈沉淀蛋白的方法，提取血浆中包括酸性、碱性和中性的药物(主要包括成瘾性镇痛药、麻醉药，抗精神病药、苯二氮革类等主要作用于中枢神经系统的药物)共61种，并用高效液相色谱法(HPLC)分析。蛋白沉淀HPLC法可以满足STA的要求，同时该方法可对本文中的大部分药物进行血药浓度监测。

1实验部分

1．1 仪器

System Gold高效液相色谱仪 (配125泵、168二极管阵列检测器(DAD)、508E自动进样器)和32Karat色谱工作站(美国Beckman公司)；Agilent TC—C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm；美国Agi1ent公司)；2-5型离心机(德国Sigma公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

1．2对照品与试剂

乙腈、磷酸(HPLC级，美国TEDIA公司)；磷酸二氢钾、高氯酸(分析纯，上海试剂有限公司)；药物对照品(名称及批号详见表l，除了强痛定和尼可刹米采用天津金耀集团有限公司生产的注射剂外，其余的均购于中国生物制品检定所)；1-硝基丁烷(GC级，瑞士Sigma．Aldrich公司)；空白血浆(本院体检中心，健康体检者的混合血浆)；血浆样品(取有药物中毒可疑性病人的静脉血于肝素管中，经离心后取上层血浆)。

1．3标准溶液、含药血浆及内标溶液的配制

精密称取药物对照品10．0 mg，用甲醇-水(体积比为l：1)溶液溶解定容至10．0 mL，得1．0 g／L的贮备液(4℃冰箱中保存)，临用前再稀释至所需浓度。

取空白血浆10．0 mL，加入适宜浓度的药物标准溶液，配制所需浓度的含药血浆。精密称取1-硝基丁烷10．0 mg，用甲醇溶解定容至10．0 mL，得1．0 g／L的内标溶液(4℃冰箱中保存)。

1．4样品处理

于1．0 mL含药血浆中加入1．5 mL乙腈，涡旋1 min混匀，以6 000 r／min离心15 min，取上清液，经0．45μm滤膜过滤，过滤后的液体直接用于

HPLC测定。

1．5色谱条件

流动相：准确称取2．72 g磷酸二氢钾溶于一定量超纯水中，加入2 mL 20％磷酸，再加入超纯水，定容至1 000 mL得磷酸盐缓冲溶液(A相)；乙腈(B相)。梯度洗脱程序：B相从初始5％经30 min升至5096，再从5096经5 min升至80％，流速：1.5mL／min；柱温：35℃；进样体积：50斗L；扫描波长：200～364 nm；检测波长：210 nm。选择1-硝基丁烷作为内标。每个样品溶液取1 mL于自动进样瓶中，再向每个样品溶液中加入10μL内标溶液，以样品和内标的保留时间比值计算相对保留时间(RRT)。

1．6萃取回收率与最低检出限(LOD)

将61种药物分为4组，保留时间相近的药物分在不同的组别，使一次色谱分析中有尽可能多的药物同时分离，并且使其保留时间能较为均匀地分布在整个分析时间窗内。各组萃取回收率的获得方法如下：取适宜浓度的药物标准溶液加至空白血浆中，作为回收率试验用的含药血浆(血浆中药物的质量浓度均为1．0和10．0 mg／L两个水平)，按1．4节的样品预处理程序进行处理，萃取后进样所得的药物峰面积与相应浓度的药物标准溶液直接进样所得的峰面积比值，即为萃取回收率。以低浓度加标血浆相应药物的浓度与响应值作为比较，并以信噪比(S／N)为3计算LOD[12]。

1．7建立紫外光谱数据库及相对保留时间数据库

将100 mg／L各药物单标准溶液稀释到适宜浓度(使其光谱吸收度在200—300 mAU)，加入适量内标，所得溶液分别进入色谱柱，得到各药物的相对保留时间及紫外光谱图，从而建立药物的相对保留时间数据库及紫外光谱数据库。

1．8样品的测定

取1．0 mL血浆样品，按1．4节方法操作，从所得的上清液中取1．0 mL置于自动进样瓶中，再加入10μL内标溶液，用于HPLC测定。未知药物根据其相对保留时间和紫外光谱图定性。

光谱相似指数(similarity indices，SI)被定义为两光谱矢量夹角(θ)的余弦值，即SI=cosθ[13]，SI由色谱工作站自动计算。当紫外光谱SI≥0．999 0认为光谱一致。

2 结果与讨论

2．1色谱条件的优化

有文献报道采用等度洗脱方法用于STA，并且认为等度洗脱使保留时间的重现性更好，在整个运行过程中紫外背景恒定，在定量上更具有优越性[14]。然而由于我们测试的药物有61种，其极性范围大，难以应用一种等度洗脱方法进行洗脱。因此采用梯度洗脱的方法，通过不断提高乙腈的比例，使不同极性的化合物能够在一次色谱分离中达到同时分离，化合物的保留时间能较均匀地分布在整个分析时间窗内。整个分析过程持续35 min，这个分析时间对于紧急情况下药物的筛查分析较为适合。另外，考虑到STA色谱系统的通用性，采用硅烷基键合相作为固定相[15.16]。

必须指出的是，由于61种药物要在35 min内被洗脱，平均峰宽约为0．5 min，不完全分离的机会是很多的，这也是STA研究中不可避免的一个问题[17]。由于本文采用HPLC-DAD为分析手段，DAD产生的紫外光谱可提供化合物相对多的信息；而药物的紫外光谱图的多样性允许可以有几种药物阳性同时存在；对于实际临床的中毒病人，同时5种以上药物中毒的病例是罕见的，因此本方法对于未知药物的中毒鉴定仍具有较大的可行性。

2．2紫外光谱数据库和相对保留时间数据库

本文采用1．硝基丁烷为内标，以相对保留时间作为物质鉴定的参数之一，从而建立了61种药物的相对保留时间数据库，相对保留时间见表1。按照1．7节的方法建立了标准紫外光谱数据库，保存在32Karat色谱工作站中。

2．3蛋白沉淀剂的选择

常用的蛋白沉淀剂主要有以下几类，如甲醇、乙腈等有机溶剂，酸性沉淀剂如高氯酸等，以及一些无机盐和重金属。尝试用高氯酸对部分药物进行预处理，方法为：于1．0 mL含药血浆中加入1．0 mL 5％(体积分数)高氯酸，涡旋1 min混匀，以6 000r／min离心15 min，取上清液，经0．45μm滤膜过滤，过滤后的液体直接用于HPLC测定。结果发现其对高极性药物如乙酰氨基酚、可待因、苯丙胺、咖啡因、山莨菪碱、尼可刹米、司可巴比妥等的回收较好，回收率为50．05％一103．56％；而对异丙嗪、卡马西平、氯丙嗪、氯普噻吨等低极性药物的回收差，回收率只有8.44％43.00％。我们认为这是由于低极性药物在高氯酸中的溶解性较差，从而与血浆蛋白共沉淀造成药物损失所致。由于高氯酸沉淀方法不能对所有测试药物进行定量回收，因此不适合用于STA的样品前处理。

考虑到乙腈溶液对测试的61种药物具有较好的溶解性，故采用乙腈作为蛋白沉淀剂进行试验，按1．6节对61种药物的加标血浆进行萃取回收率测定，以S／N=3计算LOD，结果见表l。

表1中61种药物的回收率均大于80％，相对标准偏差(RSD)为0．94％～1 1．23％。48种药物的LOD低于0．10 mg／L，只有3种药物的LOD≥0.20mg／L。由于大多数药物的中毒浓度大于0.10mg／L，因此用乙腈沉淀蛋白的方法能满足STA的需要，且很多药物(如抗癫痫药、巴比妥类、茶碱类药物等)可直接应用该方法进行治疗药物的监测。

沉淀蛋白的一个优点在于从血浆中提取的待测物没有选择性，因此血浆中待测物只要有足够的量存在，就可被提取，这一优点特别适合于STA。另外的优点还在于其简便、快速、经济且回收率高。由于蛋白沉淀方法没有浓缩步骤，所以其检出限会受影响。由于通常系统毒物分析样品的浓度较高，并且大部分药物的中毒浓度高于LOD[18]，所以该方法可以满足实际测定的要求。而对于少量药物如芬太尼、阿托品、东莨菪碱，其中毒浓度低于LOD[18]．因此当这些药物以低于LOD浓度出现时可能会检测不出来。

图I为经蛋白沉淀预处理的空白血浆的色谱图。从图1中可见，空白血浆的干扰峰较少。图2a为21种药物及内标的标准溶液色谱图，图2b为21种药物的加标血浆经蛋白沉淀预处理后的色谱图。从图2可见所测药物的保留时间能较为均匀地分布在整个分析时间窗内，峰形尖锐且分离良好。

2．4方法的应用

应用本文建立的方法对临床上15例未知药物中毒的样品进行检测，成功鉴定出12种药物。图3和图4分别为两病例血浆样品按1．4节样品处理后的HPLC色谱图。病例l的血浆中检出了利多卡因与多索茶碱(见图3)，SI均为0．999 8，质量浓度分别为14．1 mg／L和10．3 mg／L。病例2的血浆中检出苯妥英钠(见图4)，SI为0．999 8，质量浓度为47．8 mg／L。

3 结语

本文将乙腈沉淀蛋白与HPLC-DAD技术相结合，建立了血浆中包括成瘾性镇痛药、麻醉药、抗精神病药、苯二氮革类等61种主要作用于中枢神经系统药物的筛查分析方法，并成功应用于临床药物中毒样品的分析，方法简便、快速，回收率高。

（全文完）

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2011/7/20 17:27:17 76楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

（47讲）BDMPEA 毒品的GC/ MS 分析

摘要: 　目的　建立了一种毒品溴2 ，5 二甲氧基苯乙胺（缩写BDMPEA）的提取检验方法。　方法　采用GC/ MS 方法进行毒品成分确正。　结果　从缉获的毒品片剂中检出了BDMPEA、麻黄素、非那西汀、咖啡因、巴比妥及茶碱等物质。结论　为我国禁毒有关部门统计和追踪该类毒品提供了相关参考资料。

作者介绍：公安部物证鉴定中心的于忠山、张春水、王朝虹、张继宗、朱　军、郑　珲。共同完成一个毒品案子的总结。　摘自《刑事技术》2004年第一期。

第一作者于忠山(1963 —) ，男，山东省文登人，副研究员，学士，主要从事毒物毒品分析工作。Tel : (010) 63434039

前言

BDMPEA ，化学名称为溴2 ，5 二甲氧基苯乙胺，结构见图1 ，英文名称又可称为2CB ，Venus ，Bro2mo ， Nexus ， MFT ，分子式C10 H14 BrNO2 ，分子量259[1 ] 。根据联合国禁毒署提供的资料(2003 年) ，其曾经在南非被合法使用，市面上流行的许多该类药物均来源于那里，但也有资料显示目前它已经开始在世界其他的国家和地区出现，如DEA 华盛顿地区报告该类药物曾经被缉获过，另有报告指出其在德国和瑞典也很受欢迎。虽然国外BDMPEA 的滥用情况较少，但它却有很大的精神刺激作用，其药力比MDMA(3 ，4 亚甲基安非他明) 高10 倍，服用者的视觉和听觉能力显著增强，性欲高涨，味觉和触觉感觉也有很大提升。该类毒品一般是以丸剂、胶囊或粉剂形式出现，剂量范围在5～10mg ，并有严重的副作用，包括精神混乱，脱水等症状。目前我国刑事及禁毒部门还未有该毒品的技术检验和缉获的报告，笔者采用GC/ MS 成功分析了BDMPEA

实验

1 　实验部分

1.1 　样品和试剂

1 粒毒品片剂(“SSS”图案，2003 年间在安徽省缉获) ，乙醇(分析纯，北京化工厂) 。

1.2 　仪器条件

QP-5050A 气相质谱联用仪(日本岛津制作所产品) ;DB-25 MS 毛细柱(30m ×0.25mm ×0.25μm) ；进样口温度( INT) 280 ℃；离子源温度(DET) 250 ℃；载气:氦气；流速:

1ml/ min；质量范围:40 ～ 500M/ Z；温度程序: 100 ℃ ( 3min) —40 ℃/ min —280 ℃。

1.3 　方法

取缉获的片剂，机械磨碎或用小刀从四周刮下少许粉末，转移到10ml 圆底试管中，加入5ml 乙醇溶剂，在震荡器上充分震荡5 min 后，以6000r/ min 转速离心5 min ，取1μl 上清液进样分析[2 ] 。

2 　结果和讨论

2.1 　BDMPEA 结构特点

BDMPEA 是苯乙胺类物质的化学合成毒品，结构与DOB (图1) 相似(分子式C11 H16BrNO2 分子量273) ，主体结构均为苯环溴代物，所不同的是BDMPEA 仅仅比DOB 少了一个甲基。虽然BDMPEA 被当作MDMA 药丸进行贩卖，但在物质结构上相差甚远，另外其药力也比MDMA 增强了10 倍。

2.2 　制剂特点

该片剂除检出BDMPEA 物质外，同时也检出了麻黄素、非那西汀、咖啡因、巴比妥及茶碱等辅助成份，从BDMPEA 结构来分析，这些辅助成份可能是添加辅料，并不是合成中间体。另外用归一化方法(目标峰面积/ 全部峰面积×100 %) 对该片剂毒品GC/MS 分析产物进行含量估算，BDMPEA 的含量低于10 % ，说明该片剂毒品是制剂产品，而不是合成产品。

2.3 　质谱分析

BDMPEA 的质谱离子主要有三对比例相当的离子碎片组，分别是215M/ Z 和217M/ Z、230M/ Z 和232M/ Z(基峰) 、259M/ Z(M+ ) 和261M/ Z ，这是因为BDMPEA 含Br 基团，同位素离子比例是1∶1 所致。

（全文完）

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（48讲）

小型化毛细管电泳-电化学检测法测定猪尿和猪饲料中的β-兴奋剂

摘要: 采用小型化毛细管电泳-电化学检测技术测定了猪尿和猪饲料中的克伦特罗

( clenbuterol，俗称瘦肉精) 及其替代品莱克多巴胺( ractopamine 和沙丁胺醇( salbutamol) 。考察了工作电极的氧化电位、运行缓冲液的酸度和浓度、分离电压和进样时间等因素对分离和检测的影响。以直径300μm 的碳圆盘电极为工作电极，检测电极电位为+ 0.95 V ( vs SCE) ，在100 mmol /L的硼酸盐(pH 9.15)运行缓冲液中，上述3种组分在7 m in内实现了较好的分离。被测物浓度与峰电流在3个数量级范围内呈良好的线性关系，检测限为1.20 ×10 ^{- 7} ～2.06 ×10 ^{- 7 g /mL}。该方法简单可靠，已成功应用于猪尿和猪饲料样品中3种β-兴奋剂的测定，是一种有效的食品安全分析检测方法。

作者介绍

本文是上海市科研计划基金项目(06D Z05125)内容之一，华东师范大学化学系的王伟宇、张玉莲、邢晓平、王金妍，、石　雪和叶建农等师生们共同完成，发表在《色谱》第26卷第2期p228~231上的项目论文。

第一作者王伟宇的联系方式：021-62233528 wywang1983@hotmail.com.

博士生导师:叶建农教授的联系方式： jiannongye@hotmail.com.

前言

β-兴奋剂(βadrenergic agonist； β-agonist)的全称为β-肾上腺素兴奋剂(BAA ) ，又称β-激活剂，是一种化学结构和生理功能类似肾上腺素和去甲肾上腺素的苯乙醇类衍生物，它能与动物体内大多数β-肾上腺素受体相结合，导致细胞代谢过程改变。20世纪80年代有人发现，在饲料中添加β-兴奋剂具有营养成分再分配作用，能使肌肉比例提高，增大

禽畜的瘦肉率，因此β-兴奋剂一度被用作畜牧业中的饲料添加剂。β-兴奋剂易在动物组织特别是内脏中积聚残留，并可通过食物链进入人体，严重危害人类健康。欧美等国先后立法禁止在畜禽生产中使用β-兴奋剂作为饲料添加剂[ 1 ] 。我国政府也明令禁止使用克伦特罗(俗称瘦肉精) 、沙丁胺醇等作为饲料添加剂，且严格控制动物性食品中β-兴奋剂的残留量。为更好地控制克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇等的非法使用，迫切需要建立一种快速、简便、有效的检测方法。

　　薄层色谱法[ 2 ] 、气相色谱-质谱联用法( GC-MS ) [ 3，4 ] 、高效液相色谱法(HPLC ) [ 5 - 8 ] 、免疫分析法( IA ) [ 9，10 ]等已经应用于β-兴奋剂的检测，但上述方法普遍存在检测周期长、分析成本高、某些方法灵敏度比较低等缺点，有些还需复杂的样品前处理或衍生化。毛细管电泳(CE)具有分离效率高、分析速度快、重现性好、样品和试剂用量少等优点，是高效的分离分析技术之一。它与电化学检测方法( ED )联用，对具有电活性的物质有很高的灵敏度和选择性。小型化毛细管电泳分离装置与常规毛细管装置相比，分析速度更快，适宜于实际样品中被测成分的快速检测。本文使用小型化的毛细管电泳-电化学检测技术测定猪尿和猪饲料中的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇，在7 min 内即可实现上述3种物质的分离检测，为食品安全监控提供了一种有效快速的分析测试方法。

1　实验部分

1. 1　仪器和试剂

小型化的毛细管电泳-电化学检测系统( CE-ED )为自组装，包括直流高压电源(中国科学院上海应用物理研究所) ；固定毛细管和检测池及进样转盘的有机玻璃(如图1，在有机玻璃的左端，固定有检测池，里面是三电极体系；右端是进样用的转盘，转盘的外侧有用于插进样管的小圆孔，旋转

转盘即可连续进样) ； 14.5 cm 长熔融石英毛细管(内径25 μm ，外径360 μm ， Polymicro Technologies，USA) ， BAS LC-3D 安培检测器(Bioanalytical Bystems， USA) ， XWDT-164型双笔记录仪(上海大华仪表厂) ， TGL-16C 型离心机(上海安亭科学仪器厂)

克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇均购自上海安谱公司，其他试剂均为分析纯，各标准品均按说明使用。猪尿分别取自湖北和吉林的个体养殖户，猪饲料购自饲料供应站。用蒸馏水配制3种标准品质量浓度均为1.0 ×10 ^{- 3 g /mL}储备液，于4 ℃下避光保存；其他不同浓度的工作液，用运行缓冲液稀释储备液得到。

1. 2　样品处理

　　将猪尿离心( 2 000 r /min ) 10 min 后，用0.22μm 的聚丙烯滤膜将上层清液过滤后存于5 mL 容器中备用。

　　将猪饲料磨成粉状，准确称取其粉末2.00 g，置于25 mL 容量瓶中，加入乙醇2水(体积比为4∶1)混合溶液10 mL，超声萃取2 h ( 50 Hz， 19 W ) ，离心(2 000 r /min ) 10 min，上层清液经0.22μm 聚丙烯滤膜过滤后存于5 mL 容器中备用。

1. 3　碳圆盘电极的制作

　　将铜导线与直径为300 μm 的碳棒相连，然后将碳棒外侧用聚氨酯清涂料包覆制成碳圆盘电极，在室温下放置24 h 固化后备用。使用前碳圆盘电极端面用金相砂纸抛光，并置于二次蒸馏水中超声清洗5 min。

1. 4　实验方法

　　使用自组装的小型化CE-ED 装置，电化学检测为三电极体系，直径300 μm 的碳圆盘电极为工作电极， Ag /AgCl电极( SCE )为参比电极；铂丝为辅助电极。采用电动进样，条件为在1.15 kV 下从毛细管阳极端进样6 s。运行缓冲液为100 mmol/L硼砂溶液(pH 9.15) 。试液与运行缓冲液均经0.22μm 聚丙烯滤膜过滤后再使用。

2　结果与讨论

2. 1　电泳条件的选择

2. 1. 1　电极电位的选择

　　在电化学检测中，加在工作电极上的工作电位直接影响检测的灵敏度、检测限和电极的稳定性。因此，有必要研究电极电位对被测物峰电流的影响以确定最佳的检测电位。

　　工作电极的工作电位对被测物峰电流的影响如图2所示。随着工作电位的增加，峰电流增大。当工作电位超过+ 0.50 V ( vs SCE)后，峰电流迅速上升；当工作电位超过+ 0.95 V ( vs SCE )后，虽然所有被测物都产生更大的峰电流，但同时由于基线电流也急剧增加，信噪比反而有所降低。综合考虑选择工作电极的工作电位为+ 0.95 V ( vs SCE) ，此时信噪比较高，电极的稳定性较好。

2. 1. 2　运行缓冲液的酸度和浓度的选择

　　运行缓冲液的酸度直接影响毛细管的ξ电位，从而影响电渗流( EOF )的速率，同时溶液的酸度也决定样品中各组分分子的电荷情况，进而影响各组分的迁移时间和分离度，所以对运行缓冲液的酸度进行优化是获得良好分离条件的关键。本文选择pH 9.15的缓冲液作为运行缓冲液，在此pH 条件下，各组分间的分离度较好。

　　除了运行缓冲液的pH 值外，缓冲液的浓度也是影响分离度、峰电流、迁移时间等的另一个重要因素。在pH 9.15的条件下，随着缓冲液浓度的增加，被测组分的分离度得到了提高，但同时被测组分的迁移时间变长。为了取得较好的分离效果，本文选择100 mmol/L 硼砂溶液(pH 9.15)作运行缓冲液。

2. 1. 3　分离电压和进样时间的选择

对于一定长度的毛细管，分离电压决定电场强度，从而影响被测组分的迁移速度和电渗流的速度，进而影响各组分的迁移时间。分离电压对迁移时间的影响如图3所示。

分离电压越高，迁移时间越短，但过高的分离电压会降低分离度；而过低的分离电压，会导致分析时间过长，使被测组分峰展宽。在本实验中，当分离电压为1.15 kV时，所有被测组分在7 min内实现了较好的分离，因此选择1.15 kV 为工作电压分离电压为1.15 kV时，选择进样时间分别为2， 4， 6， 8， 10 s，测定克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的峰高与进样时间的关系，发现进样时间高于6 s后峰高增加幅度不大，却引起电泳峰展宽、峰拖尾等现象发生，所以本文在分离电压为1. 15 kV时，选择进样时间为6 s。

在优化条件下测得的克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的混合标准溶液和实际样品的电泳谱图如图4所示。

2. 2　重现性、线性范围及检测限

　　在上述优化条件下，将1.0 ×10^{- 5 g /mL}克伦特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇的混合标准溶液连续进样7次，峰高的相对标准偏差(RSD )分别为2.90%，3.02%和1.69%，结果表明方法的重现性良好。

　　配制一系列不同浓度的3 种组分的混合标准液，在优化条件下，考察各组分的线性范围，得出各组分的线性回归方程，并以3倍信噪比对应的浓度为检测下限。3种组分的线性范围和检测下限如表1所示。

2. 3　样品及回收率测定

分别取经0.22μm 聚丙烯滤膜过滤后的猪尿和猪饲料适量(使实际样品中的峰高既不低于检测限，也不超出所选量程) ，用运行液稀释至1 mL，在优化条件下测定。取等量的实际样品，加入3种标准品，稀释至1 mL，在优化的条件下检测，通过峰高的增长来对实际样品中的物质进行定性。猪尿和猪饲料中3种β-兴奋剂的含量如表2所示。检测结果表明，所有实际样品中均含有克伦特罗的替代品沙丁胺醇或莱克多巴胺，说明由于相关部门加强了对瘦肉精的监管和打击力度，不法商人改头换面，以沙丁胺醇或莱克多巴胺作为瘦肉精的替代品，企图逃避监管，继续非法牟利。

取等量的实际样品(猪尿) ，加入如表3所示的标准品，测得加标后的峰高，从而计算出回收率。回收率的测定结果见表3。

上述分析结果表明，本方法准确性好、灵敏度高，为猪尿和猪饲料中3种β-兴奋剂的同时分析检测提供了一种行之有效的方法。

（全文完）

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（49讲）质谱联用技术研究进展及其在药物分析中的最新应用

摘要:

目的　综述近年来质谱联用技术的研究进展及其在药物分析中的最新应用。

方法　主要介绍液相色谱-质谱(LC-MS) 接口进展及气相色谱-质谱(GC-MS) 、液相色谱2电喷雾离子化质谱(LC/ESI/MS) 、液相色谱2大气压化学离子化质谱(LC/APCI/MS)等技术在药物分析中的最新应用。

结果及结论　质谱联用在技术上,尤其是大气压电离接口/ 离子源方面取得了很大进展,同时GC-MS ,LC-MS 已广泛应用于药物学多个领域,在药物分析发展中占重要地位。

作者介绍 本文由中国医学科学院和中国协和医科大学基础医学研究所的庞焕和文允镒两位共同完成的北京市自然科学基金资助项目(7002025)部分内容，摘自发表在《中国药学杂志》第36 卷第7 期上的综述论文，现全文介绍如下　

前言

体内药物分析是分析化学技术在药学领域中的具体应用。色谱分析、光谱分析以及两谱联用技术是当今药物分析领域中最主要和最基本的研究手段。随着各种新型电离技术的发展,质谱技术已成为最有前途的分析手段之一,在测定生物大分子及药物分析等方面得到广泛应用。色谱2质谱联用技术结合了色谱、质谱两者的优点,故为分析化学进展的热点。质谱作为理想的色谱检测器,不仅特异,而且具有极高的检测灵敏度。传统的气相色谱-质谱(GC-MS) 可以使样品的分离、定性及定量一次完成,对于药物分析,尤其是对体内的药物分析起到极大的促进作用[1] 。随着新液相大气压电离技术的革新,液相色谱-质谱(LC-MS) 在生物医学等领域的地位越来越重要[2 ] 。其分析范围更广,在药物代谢、药物浓度监测和药理研究方面正逐渐取代经典的GC-MS。本文主要介绍LC-MS 接口技术的进展以及GC-MS ,LC-MS 在药物分析方面的最新应用。

应用

1 　LC-MS 接口技术的进展

1. 1 　大气压电离(atmospheric pressure ionization , API) 技术

API 技术是当今质谱界最为活跃的领域,它的成功发展拓宽了质谱仪分析化合物的范围,在药物和毒物分析方面受到人们的重视,在测定生物大分子的分子量方面也得到广泛的应用。API 主要包括电喷雾离子化(electrospray ionizaton ,ESI) 、气动辅助电喷雾即离子喷雾离子化(ionspray ionizaton ,ISI) 和大气压化学离子化(atmospheric pressure chemical ionizaton ,APCI) 3 种模式。它们的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室完成,离子化效率高,大大增强了分析的灵敏度和稳定性。ESI ,ISI 和APCI 三种电离方式同时可作为LC-MS 的接口。

API 接口/ 离子源由5 部分组成: ①液体流入装置或喷雾探针; ②大气压离子源区,通过ESI、APCI 或其他方式在此产生离子; ③样品离子化孔; ④大气压至真空接口；⑤离子光

学系统,在此将离子运送到质谱分析器。LC-MS 的API 接口/ 离子源的工作原理如下:LC 的柱流出物被雾化进入大气压离子源区。雾化方式有气动,如加热雾化器APCI ,通过强电场作用如ESI ,或以上二者联合,如气动辅助ESI(“ISI”) 。另外还有超声辅助电喷雾雾化。这些离子同溶剂蒸汽及氮气浴气体通过离子化样品孔进入初级泵。气体、溶剂蒸汽及离子混合物被超声膨胀进入低压区(10～100 Pa) 。膨胀体的中心有离子和其它高分子量物质,它们通

过分液器进入次级泵(0. 1～1 Pa) ,它包括离子聚集及转运装置,以适当方式转运并聚集离子至质谱分析区( < 10 - 3 Pa) 。

从真空角度看,雾化高流速或是低流速液体并无太大区别,因为进样孔在大气压区与初级泵之间实际上起到了稳定的限制作用。有两种主要机制促进分析物的离子化:气相离子2分子反应以及常称为离子蒸发的过程。另外有一种新的混合机制离子化技术能提高气动辅助的电喷雾实验的灵敏度,在高于正常色谱流量及较低的电喷雾量条件下,灵敏度增加约4倍[3]。

1. 2 　接口技术进展

大多LC-MS 都要求有尽可能高的LC 流速达到接口,早期ESI 接口仅能达到5～10μL·min-1 ,而目前ISI 接口的最佳流速可达到50～200μL·min-1 ,比原来的提高了10～20 倍。尽管有人认为ESI 接口的流速可达1 mL·min-1 (甚至更高) ,但如此高的流速实际很难应用。在柱子出口和ESI 探针间加一个溶剂分离器可使柱流速从1 mL·min-1减少到100μL·min-1进入接口探针而对响应无不良影响。当样品有限时,可应用在低于1μL·流速下有效工作的纳(nano)-ESI 接口[4] 。有静态及动态两种nano-ESI 接口。静态nano-ESI 装置常特殊应用于鉴定蛋白质。将细孔nano-ESI 尖端装满蛋白液置于探针上。将探针放在离子源中,蛋白液以10～100 nL·min-1的流速喷射。这种方式进行1h 质谱实验仅能完成1μL 左右样品的分析。而动态nano-ESI装置与毛细管电泳、nano-LC、微毛细管LC 或毛细管电色谱联用,流速常在30～1000 nL·min-1 。近来动态nano-ESI 装置在设计及优化方面有很大进展。对于高流速ESI 接口,一是要求在离子源处加热以促进液滴的蒸发;另外要注意在常规分析大批生物样品期间避免离子源污染。样品中常含有大量非挥发性物质如盐和蛋白质等污染离子源。离轴电喷雾雾化似乎是一种重要改进,电喷雾、涡轮电喷雾接口常用离轴方式,即位于与轴呈30～45°的位置。另外,遮进样锥体周围应用遮盖的气流也能大大减少锥体及孔的污染[5 ] 。

2 　质谱联用在药物分析中的最新应用

质谱是研究药物的生物特性和代谢及其在体内生物转化产物的一种有效工具。由于大多数药物样品经过适当的预处理和衍生化后适于气相分析,以前人们常用GC-MS 技术进行这些研究。随着新型接口技术的出现,LC-MS 的应用越来越重要,它具有色谱分离和质谱分离的双重功能,抗干扰能力强[6] 。已被广泛应用于药物,如抗癌药、抗蠕虫药、抗生素、环孢菌素、抗焦虑药、抗癫痫药、特异性受体拮抗剂、抗氧化剂和β2受体阻断剂等的分析[7] 。

2. 1 　GC-MS

GC-MS 是检测、定性在GC 条件下挥发性药物和毒物的标准方法。尿药检测时,合适的GC-MS 分析技术可提供药物存在的可靠证据。GC-MS 的使用可在仪器、操作方法和分析方法上有多种选择。新型GC-MS 系统使用离子捕获或串联质谱来改进分析程序并提高产物[1] 。近年来MS 检测器的发展促进了GC-MS 在分析人体外源性物质方面的应用[8] 。鸦片类药物由于其滥用日益增多,因此常需测定其在生物样品中的浓度。大多数鸦片类药物都可用GC-MS 测定[9] ,由其对测定尿液中叔丁醇及其代谢物GC-MS 更是敏感。GC-MS也很容易测定安定类药物,特别是热不稳定和易挥发性的安定药。近来,氟硝西泮成为年轻人较普遍服用的滥用药物,Nguyen 等[10]建立了一种选择性强且灵敏的固相萃取及GC-MS技术来分析、鉴定人尿中氟硝西泮及其两种主要代谢产物。另外,高灵敏度的GC-MS 法还被用来选择性监测尿(E)2 ,4-烯丙戊酸的N-乙酰半胱氨酸结合物(NACⅠ,NACⅡ) 。用液-液萃取预处理,且GC 与阴离子化学离子化MS 联用,可测到具有诊断意义的NACⅠ,NAC Ⅱ二-PFB 衍生物的[M-181 ] ( - ) 碎片离子[11] 。GC-MS 还应用于分析血浆样品中二氯乙酸代谢通路[12] 、人脂肪组织中羟甲亚甲孕酮乙酸[13] 、尿中13C-三戊乙醇代谢物[14] 、苯丙胺及其衍生物[15] 以及致幻药麦角二乙胺等。

2. 2 　LC-MS

LC-MS 技术可应用于药物学各个领域。它具有灵敏度高、选择性强及速度快等特点。与紫外、二极管阵列等检测法比较,LC-MS 鉴定更准确,特异性更强,因而简化了实验步骤,减少了样品预处理过程。这些特点使LC-MS 在药物发展中占有重要地位。LC-MS 接口技术的发展使LC-MS 不断成熟,当今较先进的工具包括:APCI 及ESI。

2. 2. 1 　LC/APCI/MS 　

对于APCI , HPLC流出液在大气压离子源内通过加热并与气流结合而挥发。溶剂分子在放电针尖处通过冠状放电开始离子化。然后在大气压下用化学离子化法将溶剂离子生成分析物离子。该接口最有利的特点是其能在0. 5～2 mL·min-1流速范围内工作,因而适应传统大小的HPLC柱(4. 6 mm 内径) 。为测定服用联苯苄唑治疗脂溢性皮炎后该药的全身分布情况,Muck[16 ] 等建立了高特异性、高灵敏度的LC/2APCI/2MS。方法学建立仅用了4 周时间,

其最低检测限(LOQ) 达5 ng·mL-1 。 Dost 等[17 ]建立了一种填塞柱超临界液相色谱/ 大气压化学离子化质谱(pSFC-APCI-MS) 法用来测定颠茄碱L 提取物中的阿托品。该技术在分析前不需要衍生化且灵敏,最低检测限达700 pg。色谱偶联APCI 串联质谱对于定性定量测定

生物体内和组织提取物中对映体是一种敏感、有用的方法。其运行时间短、灵敏度高且有广泛的特异性。Bakhtiar[18 ] 等用此法测定了利他林酸、吲哚洛尔、氟西丁、奥沙西泮、普萘洛尔及尼卡地平等药物的浓度。

LC/APCI/串联MS 也可用于测定志愿者眼部滴用β2肾上腺素能受体拮抗剂噻吗洛尔后其血浆中该药物的浓度。LC/APCI/MS其它常规应用,包括头颈部癌症患者静脉注射放疗

辅助药泊非霉素(PM) 后,用HPLC分离,APCI/MS 鉴定其尿中代谢物[19] 、测定鼠血清和肌肉样本中半胱氨酸蛋白酶抑制剂和它的乙基酯类、测定狗血浆中美托咪定或其他麻醉药、鉴别甲苯噻嗪体内体外代谢物以及测定血浆中一种新的5α2还原酶抑制剂L2654 ,066 等。

2. 2. 2 　LC/ESI/MS

　LC/ESI/MS 技术在生物体内药物分析方面越来越重要。有报道用该法研究大鼠皮下给去(64 ,65)2人原胰岛素后其在体内的两种循环代谢物,该肽用2. 1 mm( ID)柱分离以达到0. 2 mL·min-1流速,因而要求100∶1 的液滴分裂比使液滴以约2μL·min-1流速进入质谱。此肽经证明是原形肽发挥药理活性的介质。人食毒蘑菇后,蝇蕈毒素和鹅膏蕈碱会引起严重的胃肠道紊乱和肝损害,因而需要一种高特异性的方法检测体液中的这些物质的水平。Maurer 等证明LC/ESI/MS 是检测尿中鹅膏蕈碱敏感而特异的方法。若使用梯度洗脱,可缩短分析时间。HPLC/ESI/MS 也用于研究治疗用促性腺激素释放激素衍生物在体内的酶降解产物。Bowers 等[20 ]用LC /ESI/MS 和LC/ESI/MS/MS 测定尿中几种甾体的葡糖醛酸和硫酸酯结合物,该法避免了结合物的酶水解。生物样品中麦角二乙胺由于其活性剂量低,GC-MS 定量

仍有很大困难。目前最有前景的方法是LC/ESI/MS[21] 。快速分析的LC2ESI2MS 法与现代高通量筛选法一起还被用来富集天然药物产物[22] 。Lee 等[23 ]最近建立了测定盐酸地尔硫唑中合成试剂N ,N2氯化二甲胺乙酯(DMC) 的LC-MS 法,用阳离子ESI 所测得的检测限低,方法直接、简单,适于常规应用。用阳离子LC/ESI/MS 还测定了组胺1 (H1)-受体阻断剂特非那定及其两种主要代谢物乙醇特非那定(TOH) 和阿扎环醇(azacyclonol ,AZ)的浓度[24] ,以及用LC-阳离子ESI-MS/MS 法同时测定人或大鼠血浆中利哌酮(RSD) 及其主要循环代谢物92OH-RSD 的水平,该法简单、灵敏、快速、精确且选择性强,可用于精神分裂症患者以RSD 治疗时进行药物监测以及研究RSD 及92OH-RSD 在大鼠体嫩的药动学和组织分布等[25] 。另外,一种选择性反相LC-MS(n) 法已被用来鉴定市售红霉素样品中红霉素杂质及相关物,ESI 接口也为阳离子方式。该法可高效鉴定未知物而不需耗时的分离纯化步骤[26] 。目前,Bevalot 等[27] 研究了一种LC/ESI/MS 方法,可定量测定运动员服用禁药后头发中的皮质激素。该检测以ESI阴离子方式进行。ESI-LC-MS 在药物分析方面的应用还包括测定血浆中吗啡及其两种葡糖苷酸代谢物、非甾体抗炎药氟尼辛及其代谢物及有效定量0.2 mL 人血浆中的福辛普利[28 ]等。

3 　展　望

近年来,质谱联用在技术及应用方面取得了很大进展。由原先只有少数专家进行研究的手段发展成为了一种常规应用的技术。目前世界各国的科学技术正以日新月异的速度飞速发展,新技术的产生、仪器设备的更新非常快。我国尚有一定差距。在国内,质谱联用技术主要用于药动学和代谢研究等药学领域中,如研究代谢物结构和药物代谢通路等方面。而国外在过去20 年里,由于接口技术的发展使质谱的应用不断扩展,除药学领域外,在生物大分子及环境等方面也获得了应用,促进了相关生命学科的发展。未来分析方法学的进步将依赖于色谱分离技术及质谱检测能力的发展。定量测定、筛选和鉴定靶药物成分以及鉴别药物未知代谢物等药物分析应用无疑会进一步推动LC-MS 等联用技术的发展。

【结束语】《兴奋剂类分析方法系列讲座》共49讲，此讲座为北京召开奥动会，反对在体育运动中使用兴奋剂及兴奋剂的分析方法介绍而办，除兴奋剂外还增加了麻醉药、安眼药、毒品及社会上滥用的部分精神系统的药物，分析内容包括的面还不够广。分析的对象是血液、尿液、唾液和毛发等生物体检物。使用分析方法有GC、GC-MS、LC、LC-MS、毛细管电泳等，体内药物分析还有许多类别应该收集。从事兴奋剂分析的网友较少，同时内容没完全公开，相关的资料也不多，但各种竞技运动（奥运会、亚运会、国家运动会和残运会等）相关单位很重视这部分的分析工作。

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