主题：【原创】反相色谱法中流动相和溶剂选择的小窍门

原文由 zxhcnf(zxhcnf) 发表:
楼主很强，只一年的液相经验感觉不像，是个高手啊

原文由 微雨燕双飞(godblesschina) 发表:
从事色谱工作快一年了，积累了一些经验，分享给大家。
1.反相色谱法分析，乙腈和甲醇哪个更好？

甲醇和乙腈是反相色谱法中最常用的有机溶剂，二者的极性和溶剂强度相差不大，但它们还是有一些差异，在此详细阐述一下。

(1）UV检测器上的响应值：在紫外区尤其是远紫外区(靠近200 nm)，乙腈的吸收远低于甲醇，这一区别产生的影响在等度条件下也许还不明显，但若使用梯度，乙腈所引起的基线漂移则远小于甲醇，这样使用乙腈做流动相，得到的色谱图不仅美观，样品的检出限也低得多，所以该指标乙腈占优；

(2)洗脱强度：乙腈的洗脱能力稍强于甲醇。如果查阅溶剂参数表，能够发现乙腈的极性指数(5.8)稍高于甲醇(5.1)，受此表启发，我曾固执地认为在反相色谱法中甲醇与水混合所调出的溶液的洗脱范围要宽于乙腈，然而实践证明与水混合时，乙腈的洗脱能力更强，随着有机相比例的升高，这种区别逐渐减小，如果是纯溶剂二者趋于一致，也就是说，混合水以后乙腈的洗脱能力还是强于甲醇的；但洗脱能力不能用作评价溶剂好坏的标准，不过对于某一项分析，如果用甲醇替代乙腈，相应的有机相比例应调高一些。

(3)选择性：二者的选择性各具特点。色谱分析中的选择性往往无法给出普遍适用的参数，这就需要实践经验支持。我喜欢进行多组分分析，在某些情况下，使用乙腈-水洗脱分离情况优于甲醇-水，比如PAEs、PAHs、酚类化合物等等，选择乙腈得到了较优的分离效果，而甲醇则不行；其他一些应用中，甲醇的选择性也会优于乙腈，比如羰基类化合物-DNPH分析和氟喹诺酮类药物(沙星类药物)，其他同行使用了乙腈，化合物并未完全分离，我进行分析时改用了甲醇，所有化合物全部分开了。这是由于有机溶剂分子的化学性质（甲醇和乙醇是质子性，乙腈和四氢呋喃是非质子性）不同所致。本人的观点，如果是多组分分析方法开发时，最好用两种溶剂进行对比，以便得出最优条件。


(4)色谱柱背压：
柱内承受的压力,根据有机溶剂的种类或混合比例的不同而异.
25℃时，甲醇/水（1：1） >水（100%）>乙腈/水（1：1） >甲醇（100%）>乙腈（100%）；40℃时，甲醇/水（1：1） >水（100%）>乙腈/水（1：1） >甲醇（100%）>乙腈（100%）；
总体而言，使用乙腈时，色谱柱的背压低于甲醇，原因是乙腈的黏度低于甲醇(25 ℃时，乙腈0.37cp，甲醇0.60cp)。该指标，乙腈占优。

综上所述，反相色谱法中乙腈的效果优于甲醇。（不考虑价格）

2.离子抑制色谱法该选何种试剂？

离子抑制就是向流动相中加入酸或碱，使弱酸或弱碱以单纯的未解离形式存在，既能增大其在反相柱上的保留又能得到更完美的峰形。该方法主要用于弱酸分析(碱性化合物通常不采用离子抑制法）。常用的酸性添加物为磷酸、醋酸、甲酸等。

对比三者的吸光值，磷酸是最小的（254 nm下约为0.04），乙酸和甲酸相差不大（254 nm下均略低于1.0），这一事实会导致一个问题——在低波长（254 nm以下）下，添加乙酸和甲酸会引起更高的噪声，这就影响了分析的灵敏度，另外由于磷酸酸性强，达到同一pH值用量更少，所以使用磷酸时噪声会更低。而在使用缓冲溶液和甲醇或乙腈进行梯度分析时，乙酸或甲酸的存在可能会对乙腈、甲醇的基线漂移起到一定的抵消作用，当然这只是猜测，还有待验证。



3.上样前样品溶剂的选择。

最好的溶剂是流动相。

上面这句话可能很多人都知道，但至于为什么要这样可能不清楚。原因：

(1)流动相作溶剂不会出现溶剂峰。在药物QC、化学品QC中，主成分和杂质定量是通过归一化法进行的，溶剂峰的出现会使主成分测定值偏离实际值，所以溶剂峰是必须要消除的，唯一的办法就是以与流动相组成严格一致的溶剂溶解样品。如果这样做还是会出峰，那可能就是不被保留的化合物了；

(2)反相分析中，如果采用洗脱强度明显高于流动相的溶剂或溶液进行溶解，往往会导致柱效下降、峰前沿、峰前分叉峰，这种影响对洗脱较快的化合物影响更甚，并且进样量越大影响越严重。原因在于强洗脱样品溶剂的加入局部增大了流动相的洗脱强度，使单种组分的前部分与后部分的保留性不一致（前部分移动快、后部分移动慢），进而导致区域展宽。

我举两个例子：

我分析氯霉素时，流动相为甲醇：水=40：60，氯霉素是用甲醇溶解的，结果塔板数不足32000/m，后来改用流动相溶解，塔板数升到了90000/m；还有一次，我分离磺胺类药物，用的梯度(起点乙腈：乙酸水溶液=12：88)，溶剂为甲醇，结果第一个峰分叉了，其余正常。要知道，如果是色谱柱损坏，那么所有的峰形均应分叉。后来改用流动相溶解，一切问题迎刃而解。

我的结论：溶剂的洗脱强度等于流动相，峰形和色谱图会很完美；若稍低于流动相，也许会有溶剂峰，但峰形会是完美的，切勿使溶剂的洗脱强度明显高于流动相。

期待其他朋友也讲讲自己积累的经验，供大家分享。

原文由 微雨燕双飞(godblesschina) 发表:
从事色谱工作快一年了，积累了一些经验，分享给大家。
1.反相色谱法分析，乙腈和甲醇哪个更好？

甲醇和乙腈是反相色谱法中最常用的有机溶剂，二者的极性和溶剂强度相差不大，但它们还是有一些差异，在此详细阐述一下。

(1）UV检测器上的响应值：在紫外区尤其是远紫外区(靠近200 nm)，乙腈的吸收远低于甲醇，这一区别产生的影响在等度条件下也许还不明显，但若使用梯度，乙腈所引起的基线漂移则远小于甲醇，这样使用乙腈做流动相，得到的色谱图不仅美观，样品的检出限也低得多，所以该指标乙腈占优；

(2)洗脱强度：乙腈的洗脱能力稍强于甲醇。如果查阅溶剂参数表，能够发现乙腈的极性指数(5.8)稍高于甲醇(5.1)，受此表启发，我曾固执地认为在反相色谱法中甲醇与水混合所调出的溶液的洗脱范围要宽于乙腈，然而实践证明与水混合时，乙腈的洗脱能力更强，随着有机相比例的升高，这种区别逐渐减小，如果是纯溶剂二者趋于一致，也就是说，混合水以后乙腈的洗脱能力还是强于甲醇的；但洗脱能力不能用作评价溶剂好坏的标准，不过对于某一项分析，如果用甲醇替代乙腈，相应的有机相比例应调高一些。

(3)选择性：二者的选择性各具特点。色谱分析中的选择性往往无法给出普遍适用的参数，这就需要实践经验支持。我喜欢进行多组分分析，在某些情况下，使用乙腈-水洗脱分离情况优于甲醇-水，比如PAEs、PAHs、酚类化合物等等，选择乙腈得到了较优的分离效果，而甲醇则不行；其他一些应用中，甲醇的选择性也会优于乙腈，比如羰基类化合物-DNPH分析和氟喹诺酮类药物(沙星类药物)，其他同行使用了乙腈，化合物并未完全分离，我进行分析时改用了甲醇，所有化合物全部分开了。这是由于有机溶剂分子的化学性质（甲醇和乙醇是质子性，乙腈和四氢呋喃是非质子性）不同所致。本人的观点，如果是多组分分析方法开发时，最好用两种溶剂进行对比，以便得出最优条件。


(4)色谱柱背压：
柱内承受的压力,根据有机溶剂的种类或混合比例的不同而异.
25℃时，甲醇/水（1：1） >水（100%）>乙腈/水（1：1） >甲醇（100%）>乙腈（100%）；40℃时，甲醇/水（1：1） >水（100%）>乙腈/水（1：1） >甲醇（100%）>乙腈（100%）；
总体而言，使用乙腈时，色谱柱的背压低于甲醇，原因是乙腈的黏度低于甲醇(25 ℃时，乙腈0.37cp，甲醇0.60cp)。该指标，乙腈占优。

综上所述，反相色谱法中乙腈的效果优于甲醇。（不考虑价格）

2.离子抑制色谱法该选何种试剂？

离子抑制就是向流动相中加入酸或碱，使弱酸或弱碱以单纯的未解离形式存在，既能增大其在反相柱上的保留又能得到更完美的峰形。该方法主要用于弱酸分析(碱性化合物通常不采用离子抑制法）。常用的酸性添加物为磷酸、醋酸、甲酸等。

对比三者的吸光值，磷酸是最小的（254 nm下约为0.04），乙酸和甲酸相差不大（254 nm下均略低于1.0），这一事实会导致一个问题——在低波长（254 nm以下）下，添加乙酸和甲酸会引起更高的噪声，这就影响了分析的灵敏度，另外由于磷酸酸性强，达到同一pH值用量更少，所以使用磷酸时噪声会更低。而在使用缓冲溶液和甲醇或乙腈进行梯度分析时，乙酸或甲酸的存在可能会对乙腈、甲醇的基线漂移起到一定的抵消作用，当然这只是猜测，还有待验证。



3.上样前样品溶剂的选择。

最好的溶剂是流动相。

上面这句话可能很多人都知道，但至于为什么要这样可能不清楚。原因：

(1)流动相作溶剂不会出现溶剂峰。在药物QC、化学品QC中，主成分和杂质定量是通过归一化法进行的，溶剂峰的出现会使主成分测定值偏离实际值，所以溶剂峰是必须要消除的，唯一的办法就是以与流动相组成严格一致的溶剂溶解样品。如果这样做还是会出峰，那可能就是不被保留的化合物了；

(2)反相分析中，如果采用洗脱强度明显高于流动相的溶剂或溶液进行溶解，往往会导致柱效下降、峰前沿、峰前分叉峰，这种影响对洗脱较快的化合物影响更甚，并且进样量越大影响越严重。原因在于强洗脱样品溶剂的加入局部增大了流动相的洗脱强度，使单种组分的前部分与后部分的保留性不一致（前部分移动快、后部分移动慢），进而导致区域展宽。

我举两个例子：

我分析氯霉素时，流动相为甲醇：水=40：60，氯霉素是用甲醇溶解的，结果塔板数不足32000/m，后来改用流动相溶解，塔板数升到了90000/m；还有一次，我分离磺胺类药物，用的梯度(起点乙腈：乙酸水溶液=12：88)，溶剂为甲醇，结果第一个峰分叉了，其余正常。要知道，如果是色谱柱损坏，那么所有的峰形均应分叉。后来改用流动相溶解，一切问题迎刃而解。

我的结论：溶剂的洗脱强度等于流动相，峰形和色谱图会很完美；若稍低于流动相，也许会有溶剂峰，但峰形会是完美的，切勿使溶剂的洗脱强度明显高于流动相。

期待其他朋友也讲讲自己积累的经验，供大家分享。