一、色谱法的几种常见类型
1、HPLC法:
(1)手性
液相色谱将“手性识别”或“手性环境”引入色谱系统中,以形成暂时非对映异构体复合物,从而直接分离药物对映体;或将对映体衍生化生成非对映体,而得以分离。即分离光学异构体可用手性固定相、衍生化后在非手性固定相上或在非手性固定相上用流动相手性添加剂形成非对映体来实现。
(2)离子交换色谱
使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团(如磺酸基和羧酸基)可以用于阳离子的分离;带正电荷的交换基团(如季胺盐)可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同,在树脂中的保留时间长短不同,从而被相互分离。可用pH程序洗脱。
(3)离子对/亲和色谱
常用反相离子对色谱,用缓冲液和加入的对离子(与被分离的样品荷相反电荷)分离。分离受pH、离子强度、温度、浓度和共存的有机溶剂类型的影响,亲和色谱,一般用于大分子,使用配合体(共价结合在固体基质上的生物活性分子),与其同类的抗原(分析介质)反应,生成可逆转的复合物,通过改变缓冲条件洗脱。
(4)正相色谱
将各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上,固定相极性>流动相极性。常用固定相:二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。适于分离水溶性的极性、强极性化合物,此时较小极性的组分比较大极性组分更快地洗脱。
(5) 反相色谱
将各种不同的有机官能团通过化学反应共价结合到固定相惰性载体上,固定相极性<流动相极性。常用固定相:烷基、苯基等非极性有机分子,最常用ODS柱或C18柱,其极性很小,适于分离非机性、弱极性离子型样品。是目前药物研发中
液相色谱的主要分离模式,通常用紫外检测器,用水作基本溶剂,选择性受溶剂强度、柱温和pH的影响,一般来说较大极性比较小极性组分洗脱更快。
紫外检测器可以用于各类
液相色谱,这类检测器要注意的是氘灯老化后的灵敏度降低,其灵敏度因仪器的设计和/或者制造厂家的不同而异。用紫外检测器和反相HPLC组合得到的色谱图不一定能真实的反映实际情况,原因是:①极性比目标化合物大得多的化合物可能被掩盖(在溶剂前沿或死体积时同时洗脱);极性比目标化合物小得多的化合物洗脱出来晚,甚至保留在柱上。为避免此情况发生,最好使用梯度洗脱法。②无紫外吸收或在检测波长处吸收相差较大的多种化合物,有时在某一检测波长处不能被检出,因为通常只用一个检测波长。为避免此情况发生,可改用其它类型检测器,如示差折光检测器;流动相许可时,最好使用蒸发光散射检测器。
(6) 分子排阻色谱
以多孔凝胶(如葡萄糖,琼脂糖,硅胶,聚丙烯酰胺等)作固定相,依据样品分子量大小达到分离目的。大分子不进入凝胶孔洞,沿多孔凝胶胶粒间隙流出,先被洗脱;小分子进入大部分凝胶孔洞,在柱中被滞留,后被洗脱。
根据样品性质可分为两类:凝胶过滤(GFC)—用于分析水溶性样品,如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核苷酸、多糖;凝胶渗透(GPC)—用于分析脂溶性样品,如测定高聚物的分子量。SEC主要依据分子量大小进行分离,因此与样品、流动相间的相互作用无关,因此不采用改变流动相的组成来改善分离度。