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液相色谱（LC）
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主题：【求助】关于反相高效液相色谱使用中遇到关于死时间测定的几个问题

浏览0 回复8 电梯直达
pan0610
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发表于：2010/04/13 16:33:10 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
大家好，有问题想求助一下。描述如下：

最近在做一个二茂铁衍生物混合物的分离，采用反相高效液相色谱法，使用的是岛津高效液相色谱仪，泵的型号是LC-20AT。我们使用二氯甲烷当溶液，流动相为甲醇-水，柱为C18。

当我们使用等度洗脱的时候，第一个样品峰出现前并无明显的“杂质峰”或者“死体积峰”；换成梯度洗脱，不论以什么样的初始比例在什么样的时间梯度内，约1分钟左右都有一个强度不大，但是还算明显，形状也不错的峰。

实验所需，我们要知道死时间，查了文献，可以用硝酸钠或者硫脲来做标定死时间的物质，就先使用手头上有的硝酸钠来做标定，溶剂是二氯甲烷。可是实际操作中发现单单走这个硝酸钠溶液也不会有明显的峰出现，是因为硝酸钠在二氯甲烷中溶解性不好导致的吗？

所以问题为：

1、色谱柱柱长L=15cm，半径r=4.6mm，流速F=1ml/min，εT为0.75。根据死时间的经验公式计算，得出结果为448秒左右。是否太长？

2、最开始提到的1min左右出一个小峰，这个峰是？可以确定不是样品峰，杂质峰可能性也不大，因为同一瓶溶液，采用自动进样，等度洗脱时不出现，梯度洗脱则必会出现。

3、是否能提供一下比较具体的死时间测定的方案。

十分感谢~~~
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houcai
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2010/4/13 20:06:08 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一般出峰时间在3min钟前，定义为溶剂峰或死体积！
1.死体积计算公式：V0=t0*Fc，与死时间和流动相流速有关！
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yukepotato
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2010/4/13 22:47:09 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
要知道司时间干嘛的啊？
一般3-5分钟之前的峰是溶剂峰，可以走一针空白看看，对比下啊！
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2010/4/14 15:48:33 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
在进样之前先进一针空白溶剂和流动相各进一针看看!!就可排除干扰了
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pan0610
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2010/4/14 16:58:38 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
感谢上面三位朋友，之前在利用公式计算的时候犯了个错误，把柱子的内径0.46直接当成半径来计算了，所以结果太大。重新算了之后为112秒左右。我又用蒸馏水配置了硝酸钠溶液进行死时间的测试，在1.89秒左右出现峰，与计算结果出入不大。
再次谢谢啦~
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sscwxb
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2010/4/15 16:35:17 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回答第二个问题，可能是流动相的水相有问题。
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caroline-
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2010/4/16 9:55:27 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
应该是溶剂峰，每个新品种进样前都应该先进两针溶剂，观察是否有溶剂峰
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微雨燕双飞
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2010/4/16 23:26:27 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 houcai(houcai) 发表:
一般出峰时间在3min钟前，定义为溶剂峰或死体积！
1.死体积计算公式：V0=t0*Fc，与死时间和流动相流速有关！

从您的公式里面，只有Fc是设定的，也就是已知的，想要知道V0或t0，必须提前知道V0或C0，所以必须得提前测出两个值才行。
“一般出峰时间在3min钟前，定义为溶剂峰或死体积！ ”，没有提供色谱柱规格和测试条件就这样说，岂不是有点武断和经验主义了。
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微雨燕双飞
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2010/4/16 23:36:15 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
“yukepotato”朋友提出用溶剂峰来测试是个好办法，当然也可以选择不保留化合物进行测试，比如使用C18柱时采用尿嘧啶进行测试。
色谱柱的死体积=柱床体积-填料体积=填料间隙体积+填料孔隙体积
柱床体积很好算，如下：

V=π×d2×L/4

π为圆周率，使用3.14即可；L为柱长，单位为cm；d为色谱柱内径，单位为cm；V为柱床体积体积，单位为mL。
比如250*4.6 mm，5 微米的柱子，柱床体积为4.15 mL。但死体积要明显小于次值，我的测试结果是，在250*4.6 mm，5 微米，100 埃的柱子上，尿嘧啶的洗脱体积为2.05 mL，所以该规格色谱柱的死体积约等于或略小于2.05 mL。
只要填料均为100 埃的全多孔硅胶，其他规格的色谱柱可以参考本人的测试结果。
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