主题：【第三届原创参赛】正交试验优化SPME-GC/MS法测定葡萄中百菌清

楼主写的什么？怎么没有内容，期待继续完善。

摘要：探索利用正交试验设计法优化固相微萃取条件，并建立固相微萃取-气质联用检测葡萄中百菌清残留量的检测方法。对试验中固相微萃取过程的影响因素：萃取时间、解吸温度、搅拌速度等进行正交试验设计，通过直观分析和方差分析区分了主次因素，确定了最佳操作条件：萃取温度40℃；萃取时间40min；搅拌速度600rpm；解吸时间5min；解吸温度220℃；洗涤时间0s。在此最佳条件下测定百菌清的线性范围为5-200μg/kg，检出限为0.12μg/kg，回收率在71.2%~116.9%之间，精密度在4.3%~10.7%之间。该试验方法简单，操作方便，满足测定葡萄样品中百菌清的实际需要。

关键词：正交试验；固相微萃取；百菌清；气质



葡萄，属落叶藤本植物。葡萄含糖量高达10%-30%，以葡萄糖为主，易被人体吸收。葡萄中的大量果酸有助于消化，适当多吃些葡萄，能健脾和胃。把葡萄制成葡萄干后，糖和铁的含量相对较高，是妇女、儿童和体弱贫血者的滋补佳品。全世界葡萄的栽培面积和总产量在各种果树中都位居首位^[1]。2007年以来，在政府的大力扶持下，太仓市连续举办了四届葡萄节，其中有一大批产品在全国、省、市评比中屡获金奖、银奖和最佳风味奖、最佳外观奖，有些基地还制订了葡萄生产标准并积极申报绿色食品、无公害食品。葡萄种植已成为太仓市农业的特色产业，为进一步提高产品质量，把太仓葡萄品牌推出国门，研究快速、准确的检测方法迫在眉睫。

由卫生部、农业部组织制定的GB 25193-2010《食品中百菌清等12种农药最大残留限》，自2010年11月1日起实施，各检测机构纷纷开始着手准备。百菌清英文通用名称chlorothalonil，商品名称百菌清、敌克等。纯品为无色结晶，熔点250-251℃^[2]，微溶于水，溶于二甲苯和丙酮等有机溶剂。百菌清是1965年开始使用的一种保护性杀菌剂，对人、畜的急性毒性低^[2]。主要防治葡萄炭疽病、白腐病等病害^[1]。美国国家环境保护总署(U.S.EPA)已经把百菌清列为可能使人类致癌的物质之一，因其对环境和食品安全具有潜在威胁[^3]。目前，国内主要采用NY/T 761-2008^[4]和S/N 2320-2009^[5]的方法检测百菌清。上述方法样品前处理复杂、耗时、成本高、取样量大，不适合大量样品的快速检测，因此建立一种操作简便、快速和检测通量大的方法具有重要意义。

    固相微萃取是1987年加拿大的Pawliszyn等^[6]首先研制出并应用于检测的一种新型的萃取方式。运用固相微萃取法对葡萄中农药残留进行检测目前国内尚未有报道，而应用该法测定水果和蔬菜中农药残留已有一些研究^[7-9]。由于影响固相微萃取效果的因素较多，合理选择试验设计方法可以提高试验效率、优化实验条件。本实验尝试将正交试验方法应用于固相微萃取-气质联用法测定葡萄中百菌清残留量。以求用较少的试验次数，又能反映各因素水平对萃取效果的影响，找到最优的试验条件。

1.3 实验方法

1.3.1 正交试验设计  参考A．Sanusi、谢文明和田孟魁等的研究方法^[7-12]，在预备试验中，对萃取温度、萃取时间、搅拌速度、解吸温度等因素分别进行了单因素筛选试验，选出每个因素中较好的5个水平，采用L25(5⁶)表安排正交试验，以目标物峰面积作为统计分析评价指标。各因素水平见表1

表1 正交试验因素水平表

Tab.1 Test factor of orthogonal in level table

水平	因素
	A	B	C	D	E	F
	萃取温度	萃取时间	搅拌速度	解吸温度	解吸时间	洗涤时间
	/℃	/min	/rpm	/min	/℃	/s
1	30	10	200	1	100	0
2	35	20	300	2	140	1
3	40	30	400	3	180	2
4	45	40	500	4	220	3
5	50	50	600	5	260	4

2 结果与讨论

2.1 结果分析

通过对正交试验数据表中极差值分析比较可知，各因素对峰面积的影响大小为：A>B>E>F>D>C。A₃B₃C₅D₂E₄F₁处理组合的峰面积最大，但通过各水平数据均值Ki比较分析得出最佳提取组合为A₃B₅C₅D₅E₄F₁。

表2 六因素五水平正交试验数据表

Tab.2 The test data of orthogonal of six factors in five-level list

	A	B	C	D	E	F
因素	萃取温度	萃取时间	搅拌速度	解吸时间	解吸温度	洗涤时间	结果
	/℃	/min	/rpm	/min	/℃	/s
1	1	1	1	1	1	1	1590
2	1	2	2	2	2	2	1464
3	1	3	3	3	3	3	2468
4	1	4	4	4	4	4	2619
5	1	5	5	5	5	5	2870
6	2	1	2	3	4	5	1918
7	2	2	3	4	5	1	2278
8	2	3	4	5	1	2	2037
9	2	4	5	1	2	3	2454
10	2	5	1	2	3	4	2355
11	3	1	3	5	2	4	1662
12	3	2	4	1	3	5	1979
13	3	3	5	2	4	1	3003
14	3	4	1	3	5	2	2574
15	3	5	2	4	1	3	2460
16	4	1	4	2	5	3	1466
17	4	2	5	3	1	4	976
18	4	3	1	4	2	5	1075
19	4	4	2	5	3	1	2354
20	4	5	3	1	4	2	1920
21	5	1	5	4	3	2	1394
22	5	2	1	5	4	3	1662
23	5	3	2	1	5	4	1255
24	5	4	3	2	1	5	1528
25	5	5	4	3	2	1	1982
K1	11011	8030	9356	9198	8591	11207
K2	11042	8359	9451	9816	8737	9336.25
K3	11678	9938	9856	9918	10550	10358.34
K4	7891	11529	10083	9926	11122	8867
K5	7821	11587	10697	10585	10443	9470
	2202.200	1606.000	1871.200	1839.600	1718.200	2241.400
	2208.400	1671.800	1890.200	1963.200	1747.400	1867.250
	2335.600	1987.600	1971.200	1983.600	2110.000	2071.667
	1578.200	2305.800	2016.600	1985.200	2224.400	1773.400
	1564.200	2317.400	2139.400	2117.000	2088.600	1894.000
R	771.400	711.400	268.200	277.400	506.200	468.000

    为了更好的区分影响萃取效率的主、次因素，以误差所在列为搅拌速度来计算，给定α=0.10^[13]，查表得F_α(4,4)=4.110，即F临界值为4.110。当F比>F临界值时，有显著性。从表3方差分析表可以看出，萃取温度、萃取时间、解吸温度对实验结果有极显著的影响。

表3 方差分析表

Tab.3 Variance analysis table

因素	偏差平方和	自由度	F比	F临界值	显著性
萃取温度	2811488.240	4	12.040	4.110	*
萃取时间	2274397.040	4	9.740	4.110	*
搅拌速度	233504.240	4	1.000	4.110
解吸时间	193887.040	4	0.830	4.110
解吸温度	1055206.640	4	4.519	4.110	*
洗涤时间	693184.557	4	2.969	4.110
误差	233504.24	4
总和	7495171.997	28

2.3 线性、方法检出限

        按照上述优化的SPME条件进行测定，其线性范围为5~200μg/L，以3倍的信噪比，并考虑新鲜葡萄样品的实际用量及操作过程的稀释倍数等估算方法检出限为0.12μg/kg。

2.4 加标回收率与精密度实验

    分别在准确称取的10g葡萄样品中添加浓度为20μg/L、40μg/L 和200μg/L三个水平的标准储备液1mL，混合均匀后密闭遮光放置半天。之后，按照上文中的样品处理方法和优化的萃取、解吸条件进行试验。每个添加水平重复测定6次，计算得回收率在71.2%~116.9%之间，相对标准偏差在4.3%~9.7%之间，满足农药残留检测方法确认的技术要求^[14]。

百菌清在设施草莓上的残留

百菌清在真姬菇及培养料中的残留

百菌清在黄瓜番茄加工前后的残留变化

多功能15%克霉灵（百菌清）弥散型烟剂成烟率的测定

Validation Data for the Analysis of Chlorotalonil in Leek Using Mini-Luke Method Followed by GC-QqQ-MS/MS
GCMSMS测韭菜中的百菌清

2012年中国农药大宗产品市场盘点——百菌清

百菌清走出低迷 
1962年，美国大祥公司（Diamond Shamrock Co.）发现了百菌清，并于20世纪70年代先后建立了两套3,000t/a的生产装置，所以百菌清也是一个拥有50年历史老产品。目前，美国、日本、意大利和韩国等均有百菌清生产，国外生产企业包括先正达、意大利的Vischim公司和日本的SDS生物技术公司等。20世纪80年代初，我国云南省化工研究所开始研究百菌清，1984年原化学工业部主持并通过了技术鉴定和基础设计的审查，并于1989年建立了100吨/年百菌清（96%）生产中试装置，从此开始了百菌清在国内的生产。

百菌清是一个保护性的杀菌剂，不像其它治疗性杀菌剂那样容易产生抗药性，它的市场相对比较稳定，不会有大的波动。2011年，百菌清全球销售额同比增长8.8%，达到3.1亿美元，主要分布在美国、日本、法国和巴西等4个高端市场，这4个市场占整个市场50%以上的份额。百菌清主要用于经济类作物，如蔬菜、水果、马铃薯等，其次用于大宗作物，如谷物和水稻等；工业上也用作涂料、电器、皮革、纸张和布料等的防霉剂。百菌清全球的需求总量约为2万吨（原药）。而同行业的产能已超过3万吨，其中主要的生产企业是先正达，其产能为9,000吨；国内企业目前的产能也已达到了2.5万吨，而国内的市场需求量仅为3,000吨制剂（折合原药为2,000吨）左右，因而国内企业的产能主要还是依靠出口来释放。2011年全年总出口量约1.35万吨，其中原药占80%，在1.1万吨左右，制剂不足3,000吨。2012年1～7月，百菌清出口量为约为9,000吨，其中原药为6,000多吨，制剂仅为2,000多吨（折百）。据中国农药工业协会统计，2012年1-10月累计产量8651.26 吨（折百量），累计销售7965.99吨。

2010年中期，大的百菌清生产企业只有3家，分别为江苏新河农用化工有限公司、江阴苏利化学有限公司和山东大成农药股份有限公司，非法生产企业较多。

从2011年开始，百菌清的价格竞争比较激烈，价格一路走低，主要原因是，国内一些非法企业在用小装置进行生产，导致一是把价格拉下来，二是市场上出现了非法竞争。但要生产好的百菌清，需要有连续化装置，才能取得稳定的产量和质量。
由于百菌清的原材料受石油价格的影响很大，导致生产成本增加；另一方面百菌清的价格在下滑，目前稳定在2.6万元左右。但同时也有有利因素，当前国内百菌清扩产的趋势得到控制，预计价格将会上涨，市场将走出低迷态势。