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2010/10/21 14:14:53 21楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3. RACE的PCR结果有杂带
RACE PCR杂带或非特异性PCR条带可能是由于以下原因：
*GSP与其他cDNA的非特异性结合会导致在扩增目的产物时得到无关产物。
*GeneRacer引物和cDNA的非特异性结合会导致产生一端带有GeneRacer引物序列的PCR产物。
*RNA降解。
*PCR管或试剂污染。
注意：杂带一般是因为没有优化PCR条件，可以加入阴性对照来确定。

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2010/10/21 14:15:19 22楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

4. 得不到全长的5’RACE PCR产物
*CIP反应后的RNA降解产生了新的带有5’磷酸的断裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo连接。一定要小心操作，保证RNA无降解。
*CIP脱磷酸不完全，可以增加反应中CIP的量或减少RNA的量。
*PCR产生了杂带，并不是真正的连接产物，可以使用上述建议优化PCR。

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2010/10/21 14:15:35 23楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

三、PCR
在进行PCR时：
*请确保您没有使用过量的起始DNA或者过高浓度的引物，也没有加入过量的Mg++
*请确保您使用了恰当的退火温度
*请确保您没有使用过量的DNA聚合酶

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2010/10/21 14:16:02 24楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

四、引物
1. 应该选择哪种纯化方法？
取决于实验目的和引物的长度
2. 为什么我订购了50nmol，但是收到却只有40nmol？
50nmol是起始量
3. 怎样制备100μM的储液？
体积（μl）=质检报告上的nmol数目×10
4. 怎样设计引物？
*一般长度20-30bp；
*至少50%的GC含量；
*避免引物二聚体和二级结构；
*引物对的Tm值应该接近。
5. 引物序列有插入或缺失？
*使用上游和下游引物多测几个克隆。
*请选择正确的纯化方法。
6. PCR无结果？
*请检查引物设计是否正确；
*请检测OD读数是否正确；
*做一个阳性对照和一个阴性对照

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