1　引言

糖类化合物是生物体的组成物质，与核酸、蛋白质一起并称为三大生命物质，目前糖类的研究尽管有了较大的进展，但与蛋白质、核酸研究的研究相比较，仍显得很落后。之所以如此，有两方面的原因，一是由于其结构的多样性及复杂性，糖类的结构比蛋白质和核酸要复杂得多，对它们的研究受分析、检测技术的限制难以深入；更主要的原因是由于对其生物学作用的了解比较肤浅，因而糖的化学研究没有受到应有的重视，糖化学的发展十分缓慢。近年来，随着现代分离、分析技术的进步及生物学研究的不断深入，人们对糖类化合物的重要生物学活性有了越来越多的认识。糖类化合物在生物体内的信号传导和生物识别等方面起着重要作用，激发了人类对糖的极大兴趣，而许多与糖相关的新兴学科如糖化学、糖生物学、糖免疫学、化学糖生物学、糖组学等也己形成并得到长足的发展。

各种色谱技术及传统电泳技术均可用于糖的分析。早年一般是采用纸色谱的方法分离单糖，随着气相色谱的应用，将单糖甲基化后进行气相色谱的分离，可使得分离的时间大为缩短、重现性也大为提高，目前仍是测定单糖组成的重要方法之一。液相色谱用于单糖及寡糖的分析，可采用正相柱（氨基柱、亲水相互作用柱等）配合折光或蒸发光散射检测器等进行分析。对于多糖，较多采用分子排阻色谱法进行，但该法存在分离效率低，分析时间长等问题。而传统的电泳则仅能分离少数带电荷的寡糖和糖蛋白，存在操作繁琐、无法准确定量及分离效果差等问题。

毛细管电泳(CE)技术是20世纪80年代发展起来的一种新的分离手段。CE所具有的高分离能力、高灵敏度、快速和简便等特点，特别是由于糖的高极性，使其在糖的分析中显示出它的优越性。

2　各种糖类化合物的毛细管电泳分析的概述

一般来讲简单的单糖是中性糖，需要将其转化成带电荷的形式进行电泳。由于单糖的pKa值一般大于11，故需选用强碱性的缓冲液(pH>11)，使糖基上的羟基去质子而带负电（因此糖类的分析一般是由负极进样的），直接进行电泳分离，用紫外(195 nm)检测，但这样检测限很高。为降低检测限，可以选用硼酸盐缓冲液，加入硼酸盐不仅会生成络合阴离子，而且会导致195 nm处的吸光度增加2~20倍，但这时，糖分子的吸光度还是很低，检出限只能限制在nmol水平。为进一步降低检测限，可采用间接紫外法，即在缓冲液中加入强紫外吸收物质，形成背景电解质，使无吸收的物质产生负吸收而进行检测的一种方法。但更多的是采用紫外或荧光衍生试剂，如2-氨基吡啶、2-氨基喹啉、8-氨基萘-1,3,6-三磺酸(ANTS)等对单糖进行标记，既可以使糖带上一定的电荷，也可以增加检测的灵敏度。或是采用质谱检测。

聚糖包括寡糖和多糖。简单单糖的分析方法也适于简单寡糖的分析。多糖一般利用酸解或酶解的方法将其转化为寡糖后进行分析。多糖也可以直接在合适的条件下进行电泳，但这方面的报道不多。

3 糖类化合物的毛细管电泳分析最新进展进行阐述

3.1 多糖的直接测定

一般而言毛细管常用的检测器是UV、荧光（包括激光诱导荧光）或是MS。但也有其他检测器的报道，如Mikus et al. 使用电导检测器测定了肝素原料中的肝素含量^[1]。文中肝素样品未经前处理，并且样品中含有等渗的生理盐水，通过一根300μm i.d. (650μm o.d.) 由乙烯丙烯氟化物制成的长21cm的毛细管作为分离毛细管，通过在运行电解质的添加高聚物（如右旋糖酐）改善分离的选择性，整个分析过程灵敏、快速、简单、并具有良好的重现性。比以往利用凝胶色谱法控制肝素质量有了很大的进步。

另一种我们在药学工作中常见的多糖类物质就是淀粉。不同来源的淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉中支链和直链淀粉的比例不同，造成其制剂学上性质的不同，而建立简便、快速、准确测定二者的含量的方法一直是分析工作者研究的方向。Herrero-Martinez 报道了使用毛细管电泳检测直链淀粉与支链淀粉比例的方法^[2]，原理是在缓冲液中加入碘，毛细管电泳作为分离手段，由于淀粉与碘具有亲和作用，可形成复合物并在560nm有吸收而被检测。整个分离过程仅用时7min，该研究中还使用到了气泡形的检测池，使其检测线达到了0.1mg/ml

同样是利用亲和作用的原理，Anikó利用脂多糖与蛋白质具有强烈的亲和作用的特性。开发了一种新的检测内毒素的方法^[3]，原理是血红素与内毒素形成复合物并在415nm有吸收而被检测，与前述的实验方法不同，血红素不是直接加入的运行缓冲液之中，而是进样前先将被测样品与血红素孵育后再进行分离。利用该方法还可将结构上“平滑的”与“粗糙的”脂多糖分离开来，用于分析内毒素的类型。

毛细管电泳还可以与其他方法相互补充用于对多糖的研究。Nicola Volpi利用HPCE技术用于Escherichia coli K4多糖在离子交换色谱分离纯化过程中的监控^[4]。使用的缓冲盐为pH9.0的40mM磷酸氢二钠、10mM硼酸钠和40mM的SDS，检测波长200nm。同样的方法也被用于Escherichia coli K5多糖的分析^[5]。

3.2 衍生化技术

由于糖类物质一般缺乏可供检测的发色基团，而且荧光检测的灵敏度通常比紫外检测的高，所以对糖类物质进行荧光试剂衍生化是一种很好的降低检测限的方法。常用的衍生试剂有2-氨基苯甲酸、3-氨基苯甲酸、对硝基苯胺（p-nitroaniline）、APTS （8-Aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt，CAS：196504-57-1）等；特别是APTS近年来被使用报道的非常多，主要是因为糖的APTS的衍生物可以在酸性和碱性的硼酸盐和磷酸盐缓冲液中进行电泳，糖类的APTS衍生物的最大吸收在455 nm，因此可以采用氩离子激光器提供的488 nm的波长进行检测，非常适合与激光诱导荧光检测器（LIF）配合使用。衍生化后检测限可达femtomole水平。

Jana 建立了一套分析细胞培养的流感病毒A疫苗产品中糖蛋白的N-多糖类型的方法^[6]。该方法主要的检测手段就是对N-多糖酶切后的寡糖进行APTS荧光标记，然后利用毛细管凝胶电泳进行分离检测。APTS标记的例子还有很多，比如Marie-Eve用APTS标记的方法，分析了聚合度在2-6的甲壳素与壳聚糖的混合物^[7]。对于APTS在衍生化过程中所出现的很多不可预知的结果，Bui等人做了系统的研究^[8]，分别比较了不同类型的单糖及低聚糖与APTS反应后的峰面积大小，研究发现不同类型的糖与APTS的反应活性不同，其中氨基糖的反应活性最弱。该篇文献对于APTS的正确应用提供了非常好的指导。

除提高衍生化试剂本身的反应活性外，改进反应的方法也是分析工作者努力的方向之一。对于氨基糖常用的衍生化手段是丹酰化，为加速氨基糖的丹酰化反应速度，微波技术被引入了氨基糖的衍生化反应中^[9]。该篇文献中由于微波反应技术使得反应速度加快了50倍，氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-甲基葡萄糖胺、N-乙酰葡萄糖胺和氨基葡萄糖醛酸被分离检测。

3.3 新型的检测器

毛细管电泳常用的其检测方式有紫外可见检测、激光诱导荧光检测、电化学检测、质谱检测等。一些新型的检测器也在发展之中。黄光明研究了与毛细管电泳结合的糖类化合物的新型催化发光定量检测器^[10]。催化化学发光是由糖在多孔三氧化二铝表面的催化氧化反应产生的。对于缺乏紫外吸收的糖类化合物，比如蔗糖、α-乳糖、麦芽糖、棉仔糖、半乳糖、木糖和葡萄糖，该检测器能够很好地实现定量检测。本方法提供了一个不需要衍生而直接检测的方案，也不需要加入离子生色团，相比安培检测器能为毛细管电泳提供更灵活的分离条件，相比质谱而言，成本也更低。该化学发光检测器具有较低的基线漂移、干扰小、线性范围宽且具有长使用寿命等特点。

4 小结

HPCE作为一种迅速发展的分离技术，在糖分析中得到广泛的应用。虽然，HPCE在糖类物质特别是多糖的分析应用上仍存在一些问题，但随着毛细管电泳的新技术不断出现，如离子液体技术、柱修饰技术、新的检测技术等，使HPCE在糖化学工作中得以发挥其快速、高效、耗样少的优点，对于开展生物体内极微量和短半衰期以及相对分子质量更大的活性糖分子的研究提供了极大的便利。相信在不久的将来，HPCE对糖类研究的贡献，必将使人类更加清楚地认识和理解生命现象中信息传递和转导过程。我们相信毛细管电泳将作为一种强有力的分析手段，势必在糖分析中发挥更为重要的作用。

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