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主题：【求助】氨基柱保留时间不稳定

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yangshaobo
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发表于：2010/12/02 12:40:20 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
有没有试用氨基柱的同仁啊？最近我买了跟国产的氨基柱做糖，流动相为乙腈：水=65:35，各个组分保留时间老是不稳定，而且呈有规律的变化。变化规律为每一次进样都比前一次进样晚出峰0.5min左右。各位老大，谁能帮忙解释一下啊？？？？？？？
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2010/12/2 12:44:18 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
加了柱温箱没有，进样前平衡了多少时间？
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yangshaobo
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2010/12/2 12:48:21 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
以前都是平衡30min，出问题后曾经平衡过2h，但是问题依旧。我觉得流动相、柱温等因素也可以排除，加柱温箱，柱温是恒温，另外在同样条件下C18柱就没有这种问题呢。哎，很费解啊。
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johne0212
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2010/12/2 13:06:29 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
晚0.5min不算太夸张呢，如果你是在同一批次流动相的条件下每一针都比前一针晚0.5min我们可以考虑是柱子，HPLC或者其它的问题。

但是用氨基柱HPLC-RID/ELSD做糖，正相色谱柱是靠水将糖洗脱出来的，你每次配置的流动相不可能保持水都是你说的35%。我经常做水相在25%-30%之间浮动，保留时间没一批次都是1-2min之间的不一致，但是没有关系只要保证我这一批次内所有样品都是出峰时间一致就可以了。另外，按照EC2002/657要求,对分析物质保留时间的飘逸可以在+/_2.5%范围浮动.

另外,按照你的叙述,平衡时间还是有点少,如果是HPLC-RID你至少要30min平衡参比池,30min平衡检测池,如果是HPLC-ELSD还可以30min.但是正相柱子不像反相柱子平衡快,寿命长的.

By the way,冒昧的问一下楼主,您好像在LC/MS版上发表过寻求作抗生素合作的实验室是不是?
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yangshaobo
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2010/12/2 13:28:37 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 johne0212(johne0212) 发表:
晚0.5min不算太夸张呢，如果你是在同一批次流动相的条件下每一针都比前一针晚0.5min我们可以考虑是柱子，HPLC或者其它的问题。

但是用氨基柱HPLC-RID/ELSD做糖，正相色谱柱是靠水将糖洗脱出来的，你每次配置的流动相不可能保持水都是你说的35%。我经常做水相在25%-30%之间浮动，保留时间没一批次都是1-2min之间的不一致，但是没有关系只要保证我这一批次内所有样品都是出峰时间一致就可以了。另外，按照EC2002/657要求,对分析物质保留时间的飘逸可以在+/_2.5%范围浮动.

另外,按照你的叙述,平衡时间还是有点少,如果是HPLC-RID你至少要30min平衡参比池,30min平衡检测池,如果是HPLC-ELSD还可以30min.但是正相柱子不像反相柱子平衡快,寿命长的.

By the way,冒昧的问一下楼主,您好像在LC/MS版上发表过寻求作抗生素合作的实验室是不是?

非常感谢您的赐教，您的叙述是在下受益匪浅。
我的情况正如您所说“在同一批次流动相的条件下每一针都比前一针晚0.5min我们可以考虑是柱子”具体点说应该是“是同一个样品，同一瓶流动相每一针都比前一针晚0.5min，”比如一个物质我早上做的时候保留时间为25min，一直做下去，到下午的时候保留时间能到50min。另外我用的荧光检测器，就是把还原糖衍生化后再上HPLC，用荧光检测器检测（衍生物的稳定性应该没问题）。
呵呵，还有，我是在LC/MS版上发表过寻求作抗生素合作实验室的帖子。
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2010/12/2 13:29:17 Last edit by yangshaobo
johne0212
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2010/12/2 14:54:14 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
梯度还是等度?按照您说的平衡时间如果购长的话,不会出现这种问题,如果您还需要衍生化的话,那是不是应该考虑溶解样品的溶剂和流动相,柱子三者之间的关系呢?
柱子是问题的主要原因,但是根本问题不一定是柱子可能是流动相,试剂和样品造成柱子的原因.
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青林
wyqql2060
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2010/12/4 8:10:26 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
我是做麦芽糖。因为做的少。还没怎么发现。
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省部重点实验室
gl19860312
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2010/12/18 9:49:43 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
基线漂移     
一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，
如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因
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省部重点实验室
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2010/12/18 9:51:06 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1、柱温波动。解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。 
2、流通池被污染或有气体。  解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。 
3、紫外灯能量不足。解决方法：更换新的紫外灯 
4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及 HPLC级的溶剂。 
5、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。解决方法：使用保护柱，如有必要，在进样之间。在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。 
6、检测器没有设定在最大吸收波长处。解决方法：将波长调整至最大吸收波长处 
7、流动相的PH值没有调节好。解决方法：加适量的酸或碱调至最佳 PH值
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省部重点实验室
gl19860312
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2010/12/18 9:54:20 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
保留时间漂移     
保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过 15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考
虑以下原因： 
1、温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。 
2、流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障 
3、色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱 
4、流速变化。解决方法：重新设定流速 
5、泵中有气泡。解决方法：、从泵中除去气泡
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省部重点实验室
gl19860312
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2010/12/18 9:56:28 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
保留时间波动
  1、温控不当
    a、调好柱温
  2、流动相组分变化
    a、防止变化（蒸发、反应等）
  3、色谱柱没有平衡
    a、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
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