目的建立HPLC法测定防己黄芪方中粉防己碱的含量的方法。方法采用Hypersil BDS C₁₈色谱柱（4.6mm×200mm，5µm）。流动相为甲醇:水（含0.03%二乙胺）=80:20，柱温30℃，流速1.0mL/min，检测波长282nm。结果粉防己碱在6.25µg·mL^-1～200µg·mL^-1呈良好的线性关系（r = 0.9993），平均回收率为94.4%，RSD = 1.6%，三种方法测定防己黄芪方中粉防己碱的含量分别为0.506mg·mL^-1，0.424mg·mL^-1和0.541 mg·mL^-1。结论本法简便，准确，重现性好，可作为防己黄芪方中粉防己碱的含量测定方法。

关键词：防己黄芪汤；粉防己碱；HPLC ；含量测定

Determination of Tetrandrine in Stephania and

Astragalus Combination by HPLC

ABSTRACT

Objective: To establish a HPLC method for the determination oftetrandrine in Stephania and Astragalus Combination Method : A Hypersil BDS C18 chromatographic column （4.6mm×200mm，5µm）served as the solid phase；methanol-water（80:20）(0.03% diethylamine) was used as the mobile phase；the column temperature was at 30℃；the flow rate，1.0ml/min；UV detection wavelength，282nm. Results : There was a good linear in the range of 6.25µg·mL^-1～200µg·mL^-1 for tetrandrine (r=0.9993).The average recovery of tetrandrine was 94.4%,the RSD was 1.6%,the content of tetrandrine in Stephania and Astragalus Combination in three method was 0.506mg·mL^-1，0.424mg·mL^-1和0.541mg·mL^-1.Conclusion : This method is simple, accurate, reproducible and can be used for determination of tetrandrine in Stephania and Astragalus.

Key words：Stephania and Astragalus；tetrandrine；HPLC; determination of content

HPLC法测定防己黄芪方中粉防己碱的含量

前言

防己黄芪汤始载于《金匮要略》，有益气祛风之功效，为治疗风水或风湿之方药，由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣组成。

防己为防己科植物粉防己Stephania terandra S.Moore的干燥根，具有利水消肿，祛风止痛之作用。防己中粉防己碱具有生物活性, 化学结构属双苄基异喹啉类化合物，具有抗心律失常、抗高血压、抗炎、抗肿瘤多药耐药性等作用 ,在抗肝、肺纤维化方面也有较强活性，其免疫机能调节及肿瘤防治等方面具有很好的应用前景。眼科药理研究表明,Tet具有对实验性葡萄膜炎和角膜炎显著而强大的抑制作用;动物活体实验显示本品能明显抑制兔晶状体后囊膜混浊和人工晶状体前膜的形成,抑制术后前房中脂质过氧化反应,减轻眼局部组织的损伤;体外研究显示其对兔皮肤纤维母细胞和结膜成纤维细胞的生长增殖以及视网膜母细胞瘤生长有显著抑制作用，提示Tet可能在眼疾病治疗方面具有广阔而良好的临床应用前景。

目前其含量测定方法有薄层扫描法，紫外分光光度法和薄层色谱荧光。2005年版《中国药典》改进了定量测定的方法，采用高效液相色谱法（HPLC法），使用离子对色谱，由于流动相加入了十二烷基磺酸钠，易分层沉淀，操作过程中严格控制温度，时间等。本实验采用HPLC法对防己黄芪方中粉防己碱进行了定量分析。

材料与方法

1 材料

1.1 仪器

Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪，紫外检测器， HPLC（3D）化学工作站。A/D电子分析天平（1/10万，日本）。KQ-500B 型超声波清洗器。紫外可见分光光度计(UV-2100,美国Labtech)。

1.2 试药

粉防己碱标准品（中国药品生物制品鉴定所提供,批号为110711-200406）,防己，黄芪，白术，甘草（市售品）

甲醇为色谱纯，水为重蒸水，丙酮，二乙胺均为分析纯。

2 方法

2.1 实验部分

2.1.1 色谱条件 Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪，Hypersil BDS C₁₈（4.6mm×200mm，5μm）色谱柱，紫外检测器。流动相为甲醇：水（0.03%二乙胺）=80:20，流速1.0mL/min，进样量20uL，检测波长282nm，柱温30℃。

2.1.2 检测波长的选择以甲醇为溶剂配制适当浓度的粉防己碱的对照品溶液，以甲醇做空白，200-400nm扫描。通过高效液相色谱仪实验表明，在282nm检测波长下，峰形好，分离度好，因此选择282nm作为检测波长，见图1。

2.1.3 对照品溶液的制备精密称取粉防己碱对照品2.00mg，甲醇溶解，定容至10.00mL，得2.00mg·mL^-1的粉防己碱对照品溶液，备用。

2.1.4 样品溶液的制备称取药饮片防己4g，黄芪5g，甘草2g，白术3g，加水60 mL ,煎煮2次，合并2次水煎液，放冷移至200mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，备用。将药液进行减压蒸馏，将残留物用丙酮分次溶解并转移至小锥型瓶中置水浴上浓缩，移至10mL刻度试管，加入丙酮溶解至刻度，为供试品溶液。依照上述方法，将水煎煮改为超声提取，将水煎煮改为乙醇煎煮，分别得三种不同提取方法的供试品溶液。

2.1.5 线性关系考察精密吸取粉防己碱对照品溶液，按1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，进行倍比稀释，加上原液共6个点，按2.1.1项下色谱条件依法进样，测定峰面积(A)。以峰面积为纵坐标，粉防己碱的浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程A = 428.69C -2.73，r = 0.9993。结果表明，粉防己碱的浓度在6.25μg·mL^-1（0.125μg）～200μg·mL^-1（4.00μg）与峰面积有良好的线性关系，见图2。

2.2 方法学考察

2.2.1 色谱系统适用性在以上色谱条件下检测，粉防己碱的保留时间为6.14min。以粉防己碱计算，分离度为1.96 。粉防己碱对照品及防己黄芪方色谱图，见图3。

2.2.2 精密度实验精密吸取粉防己碱对照品溶液0.2mg·mL^-1连续进样5次，测定峰面积，计算，结果RSD=3.0%，表明该方法有较好的精密度。见表1。

2.2.3 重复性实验精密吸取供试品溶液5份，每份进样20μL。测定

计算，结果RSD =1.8%。说明本法的重复性较好。见表2。

2.2.4 回收率实验　精密吸取供试品溶液0.5mL 4份，分别精密加入对照品溶液各0.3mL，0.2mL，0.1mL,0.0 mL,并用甲醇稀释至1.0mL混匀，取20μL注入高效液相色谱仪，计算，结果平均回收率为94.4%。见表3。

结果

取三种不同提取方法的样品，编号1，2，3，按样品溶液制备方法制备供试品溶液，进样前用0.45μm滤膜过滤。进样量为20μL。按上述方法测定并计算，结果三种样品中粉防己碱的含量见表4。

附图

讨论

1 检测波长的选择:粉防己碱的紫外吸收光谱结果显示，粉防己碱在282nm波长处有最大吸收，且在该波长处粉防己碱HPLC峰形好，分离度好，故选用此波长作为测定波长。

2 在提取方法的筛选中，分别采取了水浸泡煎煮提取；水浸泡超声提取；乙醇浸泡超声提取三种方法，以峰面积为评价指标进行考察，计算粉防己碱含量，结果分别为0.506mg·mL^-1，0.424mg·mL^-1和0.541 mg·mL^-1，乙醇提取比水得率高，水煎煮得率比超声高。粉防己碱为叔氨类双苄基异喹啉类生物碱，为脂溶性生物碱，难溶于水，水煎煮液中量少是合理的。同时也提示人们当中药有效成分水溶性不好时，制备“免煎饮片”应注意考察提取率。

3 在流动相的筛选过程中发现,如果流动相中没有二乙胺,可见峰形的拖尾较严重,其原因可能是粉防己碱中的碱性氮原子易与C₁₈色谱柱上未完全封尾的氢氧根产生的氢键结合,使其难以洗脱,造成拖尾。加入二乙胺后可取代粉防己碱与色谱柱中的氢氧根产生的氢键结合,减少粉防己碱在色谱柱上的吸附,使其易于洗脱,从而改善色谱峰的形状^[11]。综上所述,认为本方法简便、专属性强、灵敏度高且重现性好,适用于粉防己碱的定量分析。

结论

本实验确定的方法—高效液相色谱法简便、快速、准确可靠、灵敏度高，可用于检测防己黄芪方中粉防己碱的含量，以确保该药的安全、合理使用。

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