主题：【第三届原创参赛】超高效液相色谱法快速测定辣椒素类物质

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zhc609

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发表于：2010/12/03 14:02:14 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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超高效液相色谱法（UPLC）快速测定辣椒素类物质

赵春华¹ 余季金²

（ 1 青岛华测检测技术有限公司工程师 2 青岛大学教授）

摘要: 建立了超高效液相色谱法测定辣椒及辣椒制品中3 种主要辣味成分的方法。样品以四氢呋喃：甲醇（1：1）提取，采用反相高效液相色谱分离。二极管阵列检测器; 根据色谱峰的保留时间及该处的光谱图定性。以外标峰面积法定量辣椒素C、二氢辣椒素( DHC) 、降二氢辣椒素( NDHC)，结果以斯氏指数( SHU) 计。采用色谱柱：BEH C18 1.7μm （2.1rnm ×50mm ); 流动相:乙腈/水梯度洗脱；检测波长280nm; 辣椒素和二氢辣椒素RSD 分别为0.8 %， 1 . 2 %( n=5 ) ; 回收率分别为96.6 % 、 95.0 %。辣椒素和二氮辣椒素在1.0一100.0mL/L 范围内线性良好; LOD为0.05 mg/mL，LOQ为0.25mg/mL。方法能够满足快速测定辣味水平评价的要求。

关键词: 高效液相色谙; 辣椒及辣椒制品; 辣椒素同系物; 辣味水平

辣椒素类物质是辣椒果实中的辣味成分和生物活性成分，由19种以上的辣椒素同系物组成，同系物结构类似，均是由香草基胺和C8一C11支链脂肪酸组成，具体种类和含量与辣椒品种和成熟度有关，主要成份见表 1。

辣椒干、辣椒提取物及纯化辣椒素晶体中辣椒素类物质的定量分析方法主要有感宫分析法、凯氏定氮法团、铂酸钠一亚硝酸钠比色法、铝蓝比色法、FAO紫外双比色法、辣椒素分光光度法、高效液相色谱法、气一质联用、液一质联用、薄层扫描法。本方法采用超高效液相色谱法，前处理条件简单、稳定易操作。3种主要辣味成分3分钟内出峰良好，实现对辣椒及辣椒制品的辣味水平的快速、准确测量评价。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 超高效液相色谱仪(ACQUITY ^TM Utra Performance LC),配二元高压泵、二极管阵列检测器，辣椒素 ( 纯度98%，国家标准物质中心)，20±4℃;二氢辣椒素(98%国家标准物质中心)，20±4℃℃储存;甲醇(色谱纯，Teda公司，美国)，酸性氧化铝（100—200目），上海晶纯试剂有限公司，其他试剂为分析纯。

1.2 标准溶液配制

准确称取辣椒素和二氢辣椒素标准品0.010g(折算为纯品)，用甲醇溶解准确定容至10mL,配制成 l mg/mL 的标准贮备液。用甲醇逐渐稀释分别得到0，1.0，10.0，30.0，50.0，70.0

100.0 mg/L 的系列标准溶液。

1.3 样品前处理

干辣椒样品用电动粉碎机粉碎，均过0.391mm筛，称取样品1.0g（精确到0.001g）于50mL离心管内，加入1.0g酸性氧化铝粉，准确加入四氢呋喃：甲醇（1：1）溶液10mL，涡旋，震荡1min。放在超声波内超声提取30min。取出冷却至室温，取出100μL用甲醇稀释10倍(可根据样品中辣素含量确定适当的稀释倍数),混匀，过0.22μm滤膜备用。

1.4 色谱条件

色谱柱：BEH C18 1.7μm （2.1rnm ×50mm )，

流动相：A:水 B:乙腈柱温：40℃ 流速：0.2mL/min

梯度程序见表 2。

1.5 定量测定

取系列标准溶液进3μL，以浓度—峰面积绘制标准曲线(或取跟样品浓度相近的标准溶液进行单点校正)。进样品制备液33μL，以保留时间和该点出的光谱图定性，峰面积定量。去甲二氢辣椒素与辣椒素共用同一条标准曲线。

辣椒素同系物总量(以SHU计)=

ρ_NDHC 一去甲二氢辣椒素浓度，mg/L；ρ_C一辣椒素质量浓度，mg/L；ρ_DHC 一二氢辣椒素质量浓；mg/L；V一定容体积，m一取样量，g； 9300 ，16100 为SHU换算系数。

图 1、图2 、图3分别为0.01 mg/L标准色谱图、标准光谱图和样品色谱图。

图 1 标准色谱图

NDHC: 1.415min C: 1.587min DHC : 2.197mun

图 2 标准光谱图

图 3 样品色谱图

2 结果与讨论

2.1 流动相的确定及去甲二氢辣椒素色谱峰的确认

通过对常用洗脱溶剂甲醇、乙腈、水，以及流动相的PH值等条件的优化，确定了最佳洗脱条件，见1.4 色谱条件。从C的主峰分出一明显的小峰(1.415min)，且该峰与C、DHC 的峰面积比为1:3:6，基本符合辣椒中辣椒素同系物各组分含量的比例。该处的光谱图和1.587min（C）及2.197mun（DHC）处的光谱图完全一样。由此可断定该峰为NDHC，理论上可以用辣椒素的标准曲线定量降二氢辣椒素。

2.2 检测波长的确定

从图3标准的光谱图可以看出C和DHC 的紫外全波长扫描图完全一致。在230 nm和280nm 出现两个吸收峰。230nm 比280nm 的吸收值高很多且峰形平缓，作为检测长将更灵敏。但在底波长范围下有紫外吸收的物质多，就越容易产生干扰。在280nm仪器的灵敏度已经满足测试要求，故还是采用280nm来进行定量。

2.3 不同提取剂的提取效果的比较

分别采用乙睛、饱和乙睛、四氢呋喃：甲醇（1：1）、甲醇、50％的甲醇水超声提取，试验发现：四氢呋喃：甲醇（1：1）的提取效果最好。

2.4 不同净化效果的比较

考虑使用石墨化碳和酸性氧化铝净化提取物里面的色素和油脂。净化后和净化前样品图叠加如下图：

从图上可以看出，使用酸性氧化铝粉使得样品前面很大的杂质峰得到很大程度的净化，而我们所要的目标物C和DHC并没有明显损失。使用石墨化碳感觉已经除掉很多色素，但其前面的色谱杂质峰并没有很多变化，净化效果不理想。

2.5 检出限和定量限

进逐渐稀释的标准溶液以3倍信噪比(S/N)为检出限(LOD)，10倍信噪比为定量限(LOQ)。辣椒素、二氢辣椒素的LOD为0.05 mg/mL，LOQ为0.25mg/mL。

2.6 线性关系

以6个浓度水平绘制标准曲线，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标作校正曲线并进行线性回归。C标准曲线回归方程Y=7.69e+003X+1.40e+004,R=0.9996;DHC标准曲线回归方程Y=7.01e+003X+1.35e+004,R=0.9997。结果表明C和DHC 在1.0一100.0mL/L范围内线性良好。

C 校正曲线

DHC 校正曲线

2.7 回收试验

称取已知量的供试品1.0g，共9份，每3份为一组，分别加入低、高浓度水平的标准贮备液。按1.3 样品前处理方法进行处理，分别进样，由回归方程计算回收率，结果见表3，C、DHC 回收率分别为96.6%、95.0%

表 3 C、DHC 回收率实验结果

2.8 精密度试验

取 10.0 L mg/L标准溶液和样品制备溶液，按上述色谱条件。分别连续进样5次，进行精密度实验。结果标准溶液和样品溶液的RSD分别为0.8%，1.2% (n=5)。

参考文献

［1］凌关庭.天然食品添加剂，北京:化学工业出版社，2000.57

［2］吴艳阳，陈开勋，邵纪生.化学世界，2004，4:218

［3］Thomas A Betts. J Chern Edu,1999,76(2):240

［4］ISO3513; 1995(E) Chillies-Determination of Scovillie index

［5］郑新荣，袁西恩，胡宜亮.河南科学，1991，9(l):63

［6］杨玉珍，濮冶民，巩振辉.中国蔬菜，1990，2，44

［7］杨玉珍。分析试验室，1994，13(3):46

附件：

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