主题：【第三届原创作品】天美征文酮咯酸氨丁三醇残留溶剂方法学验证（FID）（12月）

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lunanjituan

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发表于：2010/12/08 22:13:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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酮咯酸氨丁三醇残留溶剂方法学验证（FID）

一、方法：甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸、甲苯称取异辛烷约20mg，精密称定，置50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，作为内标贮备液；依次称取甲醇约300mg、乙醇约500mg、二氯甲烷约60mg、乙酸乙酯约500mg、乙酸约500mg、甲苯约89mg，均精密称定，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取溶液5ml，置50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；称取酮咯酸氨丁三醇约1.0 g，精密称定，置10ml量瓶中，加DMF适量使其溶解，加1.0 ml内标贮备液，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；精密量取对照贮备液5.0 ml，置10ml量瓶中，加1.0ml内标贮备液，用DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。照气相色谱法（中国药典2005年版二部附录V E）和有机溶剂残留量测定法（中国药典2005年版二部附录VIII P第一法），用DB-624毛细管色谱柱（30m×0.53mm×3.0µm ），FID检测器，载气为氮气，进样口温度200ºC ，流速1.5ml/min，分流比5：1；柱温在40ºC下保留5分钟，然后以10ºC/min的速率升至200ºC，至少保留9分钟；检测器温度250ºC。分别精密量取上述两种溶液各1.0µl进样分析，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，含甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸及甲苯分别不得过0.3%、0.5%、0.06%、0.5%、0.5%、0.089%。

二、仪器与试药岛津GC-2010气相色谱仪，FID检测器。甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：T20080109）、无水乙醇（分析纯，汕头西陇化工厂有限公司，批号： 0808141）、二氯甲烷（分析纯，汕头西陇化工厂有限公司，批号：0710311）、乙酸乙酯（沈阳瑞丰精细化学品有限公司，批号：20050626）、乙酸（上海试剂一厂，批号：20071201）、甲苯（天津瑞金特化学品有限公司，批号：20060704）、N，N-二甲基甲酰胺（分析纯，天津四友生物医学技术有限公司，批号：070914101）、异辛烷（分析纯，TEDIA company INC.USA，批号：506173）。

三、色谱条件色谱柱：DB-624毛细管气相色谱柱（30m×0.53mm×3.0µm ）。FID检测器，载气为氮气，进样口温度200ºC ，流速1.5ml/min，进样量：1.0µl，分流比5：1；柱温：在40ºC下保留5分钟，然后以10ºC/min的速率升至200ºC，至少保持9分钟；检测器温度250ºC。尾吹：30ml/min。各峰的理论塔板数均应不低于10000，各峰的拖尾因子均应不大于2.0，各峰间的分离度均应不小于2.0。

四、气相色谱方法学验证照有机溶剂残留量测定法测定。根据合成路线，对甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸及甲苯等残留溶剂进行了方法学研究。

1、专属性试验

1.1空白基线依柱温设定条件，得基线GC色谱图。见附图。

1.2空白溶剂精密量取DMF1.0µl 注入GC，得空白溶剂GC色谱图。见附图。

1.3甲醇称取甲醇约15mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得甲醇GC色谱图。见附图。

1.4乙醇称取乙醇约25mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得乙醇GC色谱图。见附图。

1.5二氯甲烷称取二氯甲烷约30mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀,量取溶液1ml置10ml量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得二氯甲烷GC色谱图。见附图。

1.6乙酸乙酯称取乙酸乙酯约25mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得乙酸乙酯GC色谱图。见附图。

1.7乙酸称取乙酸约25mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得乙酸GC色谱图。见附图。

1.8甲苯称取甲苯约45mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀,量取溶液1ml置10ml量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得甲苯GC色谱图。见附图。

1.8异辛烷（内标）称取异辛烷约20mg，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得异辛烷GC色谱图。见附图。

1.9 对照溶液依法配制对照溶液，精密量取1.0µl 注入GC，得对照溶液GC色谱图。见附图。由色谱图可知：待测各残留溶剂间的分离度均大于2.0，相互之间没有干扰。

1.10 对照与样品混合溶液依法配制对照溶液和样品溶液，并将二者按1：1相互混合，摇匀。精密量取1.0µl 注入GC，得对照与样品混合溶液GC色谱图。见附图。由色谱图可知：测定样品溶液中的潜在杂质对待测残留溶剂样品无干扰。

2、系统适用性试验

精密量取对照贮备液5.0ml，置10ml量瓶中，加1.0ml内标贮备液，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。取对照溶液，依法连续进样六次，记录色谱图，记录各残留溶剂的保留时间、拖尾因子、理论塔板数、峰面积，计算各溶剂与内标峰面积的比值及RSD。结果见表1～7。

由此可知：待测残留溶剂甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸、甲苯及内标异辛烷均满足系统适用性试验要求。

3、线性试验

线性试验贮备溶液配制精密称取甲醇0.3007g、乙醇0.5031g、二氯甲烷0.0621g、乙酸乙酯0.4998g、乙酸0.5013g和甲苯0.0884g，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀;精密量取溶液5ml,置于50ml量瓶中, 加DMF稀释至刻度，摇匀。

内标贮备液配制精密称取异辛烷0.021g，置于50ml量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀。

线性试验溶液配制依次精密量取线性试验贮备溶液各8.0ml、6.5ml、5.0ml、3.5ml、2.0ml、0.5ml、0.1ml，分置于10ml量瓶中，再依次各精密加入1.0ml内标贮备液，加DMF稀释至刻度，摇匀。

取线性试验溶液依法测定，以各溶剂峰面积与内标峰面积比（A）对溶剂的浓度（C）进行线性回归，试验结果见表8～13。

由此可见：酮咯酸氨丁三醇各待测残留溶剂在其相应浓度范围内线性关系良好，满足线性试验要求。

4、精密度试验

4.1系统重复性试验

依法配制一份对照溶液，连续进样六次，记录各待测有机溶剂和内标峰面积并计算二者比值及RSD。结果见表14。

由此可见：重复进样后，各待测有机溶剂与内标峰面积比的RSD（%）均小于5.0%，符合重复性试验要求。

4.2中间精密度试验

A、B两人分别于第一天各依法配制一份对照溶液和六份样品溶液，A于第二天再依法配制一份对照溶液和六份样品溶液，计算样品中各残留溶剂的含量及RSD。结果见表15。

5、准确度试验

称取一批酮咯酸氨丁三醇约1.0g，精密称定，置于10ml量瓶中，加1ml内标贮备液，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，作为空白溶液；另再称取样品共九份，均约1.0g，分成三份，分置于10ml量瓶中，分别加入适量DMF使其溶解，依次精密量取线性试验对照贮备液6.0ml、5.0ml、4.0ml各三份，加入九份样品中，再依次精密加入内标贮备液各1.0 ml，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为回收率试验溶液；精密量取线性试验对照贮备液5.0ml，置10ml量瓶中，精密加入内标贮备液1.0ml，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。精密量取1.0µl上述溶液注入GC，记录色谱图，按内标法以峰面积计算甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸和甲苯的回收率，结果见表16～21。

6、稳定性试验

依法配制一份对照溶液，分别于0、1h、2h、4h、8h、10h后进样分析，记录色谱图，，记录各待测有机溶剂和内标峰面积并计算二者比值。结果见表22。

7、定量限试验

精密称取甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸和甲苯,加DMF稀释配制成一系列不同浓度溶液，依法进样分析，当S/N=10±1时，即为该溶剂定量限。此时甲醇浓度为10.10µg/ml、定量限为10.10ng，乙醇浓度为7.29µg/ml、定量限为7.29ng，二氯甲烷浓度为4.92µg/ml、定量限为4.92ng，乙酸乙酯浓度为24.59µg/ml、定量限为24.59ng，乙酸浓度为4.20µg/ml、定量限为4.20ng, 甲苯浓度为4.20µg/ml、定量限为4.20ng。

8、检测限试验

精密称取甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸和甲苯,加DMF稀释配制成一系列不同浓度溶液，依法进样分析，当S/N=3±1时，即为该溶剂检测限。此时甲醇浓度为2.91µg/ml、检测限为2.91ng，乙醇浓度为2.08µg/ml、检测限为2.08ng，二氯甲烷浓度为1.38µg/ml、检测限为1.38ng，乙酸乙酯浓度为6.94µg/ml、检测限为6.94ng，乙酸浓度为1.43µg/ml、检测限为1.43ng, 甲苯浓度为1.43µg/ml、检测限为1.43ng。

9、耐用性试验

改变柱温起始温度（±5℃）、终点温度（±5℃）、升温速率（±5℃/min）、载气柱流量（±0.5ml/min）、起始温度保持时间（±1min），取对照溶液依法进样分析，考察相邻溶剂间的分离度（R），应符合要求。结果见表23。

10、三批样品测定

称取酮咯酸氨丁三醇三批样品均约1.0 g，精密称定，置于10ml量瓶中，加DMF适量使其溶解，精密加入1.0ml内标贮备液，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液；精密量取对照贮备液5.0ml，置于10 ml量瓶中，精密加入1.0ml内标贮备液，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液。分别精密量取上述两种溶液各1.0µl注入GC，记录色谱图，按内标法以峰面积计算，结果见表24。

五、试验结论

通过对酮咯酸氨丁三醇残留溶剂方法学验证，包括：专属性、精密度、线性、准确性、定量限、检测限、溶液稳定性和耐用性考察，试验结果均符合要求。因此，该方法可以作为酮咯酸氨丁三醇残留溶剂检测方法而列入质量标准。

照有机溶剂残留量测定法（ICH）中规定的药品中常见的残留溶剂及限度，本品含甲醇、乙醇、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸和甲苯分别不得过0.3%、0.5%、0.06%、0.5%、0.5%和0.089%，依此方法检测酮咯酸氨丁三醇三批样品的溶剂残留量均符合规定。