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主题：【求助】紧急求助(黄芩苷含量测定的问题）

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liuyuan198815
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发表于：2010/12/11 21:44:37 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
今天做感冒止咳糖浆中黄芩苷含量测定时碰到了难题

色谱条件：岛津10A的机子，N2000工作站，流动相是甲醇：水：磷酸（35：65：0.3），检测波长280nm，理论板不少于3000。

对照品配制：取黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。 

供试品制备：精密量取1ml，置50ml容量瓶中，加50%的甲醇至刻度，摇匀，过滤即得。      供和对各进10ul。

问题出现：第一针对照品，跑了一小时，没任何峰出现，就是基线。
                    第二针对照品，我把波长调到278，保留时间为22.998时出峰，不过峰形难看，而且理论板数只有600多。。。
                    第三针对照品，把波长调到276（因为之前我测黄芩药材黄芩苷含量时用的波长就是276），但保留时间变成31.082？？？理论板数同2针
                    第四针对照品，把波长调到279，保留时间为34.673？？理论板数同2针
                    第五针对照品，把波长再调至276，保留时间为22.948？？理论板数同2针

我昨天做了样品，系统应该是没问题的，对照品溶液也是新配的！！！
问题1：为什么按照药典标准的波长测定无任何峰出现（当然进样也没问题）？
问题2：为什么改变波长会造成保留时间改变这么多？
问题3：为什么柱效这么差？（我用的柱子才用2星期，而且之前所做的样品柱效都不错）

现在都没法做下去了，到底是哪些方面的问题？？？大家帮忙看看！！！
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2010/12/11 23:57:50 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主用的是哪家的柱子啊？
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liuyuan198815
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2010/12/12 8:55:50 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
岛津原装的，刚用不久，柱子应该没问题的！！
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有水有渝
xky0230699
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2010/12/12 10:53:08 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
建议在276下连续进样试试，不要每进一个都换波长，因为换了检测波长，无法确定你检测到的色谱峰表达的是同一个物质。管路上有没有漏液，压力，流量正常吗？
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2010/12/12 10:53:24 Last edit by xky0230699
liuyuan198815
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2010/12/12 12:05:56 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 有水有渝(xky0230699) 发表:
建议在276下连续进样试试，不要每进一个都换波长，因为换了检测波长，无法确定你检测到的色谱峰表达的是同一个物质。管路上有没有漏液，压力，流量正常吗？


如果有很小的漏液（比如流通池有漏），系统会报警吗？选择在276下进样是不是因为药材是在276下检的？但是这改变了标准规定的测量波长，会对检测结果有大的影响吗？
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liuyuan198815
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2010/12/12 19:55:05 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
在276波长下进了三针对照品，保留时间分别为12.798、15.223、22.365，但峰面积相差无几的，为什么会这样？我测了下流速是正常的！！！然后我进样品，保留时间就更离谱了，直接45.658，我还以为不是呢，做了个加标，可以确认是目标峰，这究竟是什么原因造成的呢？
再者，我发现我今天做的系统压力比昨天的低了近20kgf(2MPa)[当然流动相比例也没变动]，如果是有漏的话机子应该会报警，但运行是正常的，这又是什么原因？哪个地方磨损了？不密封？？？
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2010/12/12 19:56:08 Last edit by liuyuan198815
有水有渝
xky0230699
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2010/12/13 20:15:39 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
276不是规定的检测波长吗？是不是色谱柱没有平衡好，或是样品污染很大，每进一次都有很大的污染，使用保留时间无法重复。
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liuyuan198815
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2010/12/13 20:43:44 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
第一、我今天打开空调再重新做了下，以前没开空调做的，室温大概是25度，以前室温只有差不多15度的样子，室温相差10度会造成系统压力有很大的改变吗？因为我没开空调的时候（15度）压力比开了空调（25度）高了近2MPa，只是流动相高了这么多，然而我冲洗柱子用的纯甲醇基本没什么变化，为什么会这样呢？

第二、我今天做的保留时间是45min（重现性也还不错），不过峰形不太好，峰高不高，不过理论塔板数比较高（毕竟保留时间这么长），而上几次做的怎么会在12.798、15.223、22.365的时间里出峰呢？是不是因为上针的没出来，而在下针出来了？因为我只在40分钟左右就停止采集了

第三、我做样用的波长是276，而药典规定是280，因为280没峰出，我这样改变规定波长做出来的结果可不可靠呢？（我是想反正对照品和样品是在同样的条件下做的，有影响应该会相互抵消吧？？？）
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2010/12/13 20:44:46 Last edit by liuyuan198815
zhanghe-2008
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2010/12/13 21:07:39 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
色谱条件：流动相是甲醇：水：磷酸（35：65：0.3），检测波长280nm，理论板不少于3000。

对照品配制：取黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。 

供试品制备：精密量取1ml，置50ml容量瓶中，加50%的甲醇至刻度，摇匀，过滤即得。     
供和对各进10ul。
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你的柱子的类型是不是错了  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子试试！！！
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liuyuan198815
liuyuan198815
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2010/12/13 21:30:06 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 zhanghe-2008(zhanghe-2008) 发表:
色谱条件：流动相是甲醇：水：磷酸（35：65：0.3），检测波长280nm，理论板不少于3000。

对照品配制：取黄芩苷对照品适量，加50%甲醇制成每1ml含15ug的溶液。 

供试品制备：精密量取1ml，置50ml容量瓶中，加50%的甲醇至刻度，摇匀，过滤即得。     
供和对各进10ul。
流速1.0ml/min
你的柱子的类型是不是错了  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的柱子试试！！！


这怎么可能呢！！！！我实验室就只有一种柱子ODS，再说我做液相也有一段时间了，当然不会连C18柱都不认识。。。。。。。
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2010/12/13 21:30:42 Last edit by liuyuan198815
wdl158160
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2010/12/14 10:33:04 11楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
楼主换瓶试剂，重新配制流动相试试，好好混合一下试试。
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