主题：【求购】关于GB5009.24-2010黄曲霉毒素测定用设备

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黄曲霉毒素B1的测定薄层层析法？

       
1 范围

本方法采用薄层层析法测定糕点中黄曲霉毒素B1 的含量。

本方法适用于糕点中黄曲霉毒素B1 含量的测定，结果表示为mg/Kg，测定值报告为整数位的数值。最低检出量为0.0004mg，检出限为5mg/Kg。

2 原理

试样中黄曲霉毒素B1 经提取、浓缩、薄层分离后，在波长为365nm 的紫外光下产生蓝色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量。

3 试剂

3.1 三氯甲烷

3.2 乙腈

3.3 苯－乙腈混合液，98＋2

取98mL 苯与2mL 乙腈混合。

3.4 无水乙醚

3.5 丙酮－三氯甲烷混合液，8＋92

取8mL 丙酮与92mL 三氯甲烷混合。

3.6 硅胶G 薄层层析板

3.7 三氟乙酸

3.8 黄曲霉毒素标准溶液，10¦Ìg/mL

准确称取1～1.2mg 黄曲霉毒素B1 标准品，先加入2mL 乙腈溶解，再用苯稀释定容至100mL，

其浓度约为10¦Ìg/mL，此标准溶液应通过紫外分光光度法测定其纯度，并以溶剂调整其浓度为10¦Ìg/mL，避光，置于4℃冰箱中保存。

3.9 黄曲霉毒素标准使用液，0.04¦Ìg/mL

准确吸取10¦Ìg/mL 黄曲霉毒素标准溶液（10¦Ìg/mL）0.40mL 于100mL 容量瓶中，加苯－乙

腈混合液（98＋2）至刻度，混匀。此溶液相当于黄曲霉毒素B1 0.04¦Ìg/mL，避光，置于4℃冰箱中保存。

4 仪器

4.1 薄层层析展开槽，内长25cm,宽6cm，高4cm，或与薄层层析板尺寸配套者。

4.2 紫外光灯，100～125W，带有波长365nm 滤光片。

5 试样制备

5.1取样

试样中污染黄曲霉毒素高的霉素一粒可以左右测度结果，而且有毒霉素的比例小，同时分部

不均匀。为避免取样带来的误差，应大量取样，并将该大量试样粉碎，混合均匀，才有可能得到确能代表一批试样的相对可靠的结果，因此采样应注意以下几点。

5.1.1根据规定采取有代表性试样。

5.1.2对局部发霉变质的试样检验时，应单独取样。

5.1.3每份分析测定用的试样应从大样经粗碎与连续多次用四分法缩减至0.5Kg～1Kg，然后全部粉碎。必要时，每批试样可采用三份大样作试样制备及分析测定用，以观察所采试样是否具有一定的代表性。

5.2 提取

准确称取20.00g 粉碎过筛试样（精确至0.01g）置于250mL 具塞锥形瓶中，加30mL 正己烷

或石油醚和100mL 甲醇水溶液，在瓶塞上涂上一层水，盖严防漏。震荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。取20.00mL 甲醇水溶液（相当于4g 试样）置于另一125mL 分液漏斗中加20mL三氯甲烷，振摇2min，静置分层，如出现乳化，则可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g 预先用三氯甲烷润湿的无水硫酸钠的慢速滤纸，过滤于50mL 蒸发皿中，再加5mL 三氯甲烷于分液漏斗中,重复振摇提取, 三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中,最后用少量三氯甲烷洗过滤层，洗液并于蒸发皿中。将蒸发皿置于65℃水浴上通风挥干，然后放在冰盒上冷却2～3min 后，准确加入1mL 苯－乙腈混合液（98＋2）。用带橡皮头的滴管管尖将残渣充分混合，再用此滴管吸取上清液转移于2mL 具塞试管中。

6 操作步骤

6.1 薄层板的制备

称取约3g 硅胶G，加相当于硅胶量2～3 倍左右的水，用力研磨1～2min 至成糊状后立即倒入涂布器内，推成5cm×20cm，厚度约0.25mm 的薄层板三块。在空气中干燥约15min 后，在100℃活化2h，取出，放干燥器中保存。一般可保存2～3d，若放置时间较长，可再活化后使用。

6.2 样品的测定

6.2.1 点样

将薄层板边缘附着的吸附剂刮净，在距薄层板下端3cm 的基线上用微量注射器或血色素吸管滴加样液。一块板可滴加4 个点，点距边缘和间距约为1cm，点直径约为3mm。在同一板上滴加点的大小应一致，滴加时可用吹风机用冷风边吹边加。滴加样式如下：

第一点：10μL 黄曲霉毒素B1 标准使用液(0.04¦Ìg/mL).。

第二点：20μL 样液。

第三点：20μL 样液＋10μL 0.04¦Ìg/mL 黄曲霉毒素B1 标准使用液。

第四点：20μL 样液＋10μL 0.2¦Ìg/mL 黄曲霉毒素B1 标准使用液。

6.2.2 展开与观察

在展开槽内加10mL 无水乙醚，预展12cm，取出挥干。再于另一展开槽内加10mL 丙酮－三氯甲烷混合液（8＋92），展开10～12cm，取出。在紫外光下观察结果，方法如下。由于样液点上加滴黄曲霉毒素B1 标准使用液，可使黄曲霉毒素B1 标准点与样液中的黄曲霉毒素B1 荧光点重叠。如样液为阴性,薄层板上的第三点中黄曲霉毒素B1 为0.0004¦Ìg，可用作检查在样液内黄曲霉毒素B1 最低检出量是否正常出现；如为阳性，则起定性作用。薄层板上的第四点中黄曲霉毒素B1 为0.002¦Ìg，主要起定位作用。3若第二点在与黄曲霉毒素B1 标准点的相应位置上无蓝紫色荧光点，表示样品中黄曲霉毒素B1 含量在5¦Ìg/Kg 以下；如在相应位置上有蓝紫色荧光点，则需进行确证试验。

6.2.3 确证试验

为了证实薄层板上样液荧光系由黄曲霉毒素B1 产生的，加滴三氟乙酸，产生黄曲霉毒素B1的衍生物，展开后此衍生物的比移植约在0.1 左右。于薄层板左边依次滴加两个点。

第一点：10μL 0.04¦Ìg/mL 黄曲霉毒素B1 标准使用液。

第二点：20μL 样液。

于以上两点各加一小滴三氟乙酸盖于其上，反应5min 后，用吹风机吹热风2min 后，使热

风吹到薄层板上的温度不高于40℃。再于薄层板上滴加以下两个点。

第三点：10μL 0.04¦Ìg/mL 黄曲霉毒素B1 标准使用液。

第四点：20μL 样液。