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荧光分析法-兽药

　

    某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。

　　（一）荧光的产生一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。

　　可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。

　　（二）荧光效率荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）

发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

　　（三）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭 ，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

  物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系，可以用作定量分析。荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法为高，浓度太大的溶液会有“自熄灭”作用，以及由于在液面附近溶液会吸收激发光，使发射光强度下降，导致发射光强度与浓度不成正比，故荧光分析法应在低浓度溶液中进行。 所用的仪器为荧光计或荧光分光光度计，按各药品项下的规定，选定激发光波长和发射光波长，并配制对照品溶液和供试品溶液。 由于不易测定绝对荧光强度，故荧光分析法都是在一定条件下，用对照品溶液测得浓度的线性范围后，再在每次测定前，用一定浓度的对照品溶液校定仪器的灵敏度；然后在相同的条件下，读取对照品溶液及其试剂空白与供试品溶液及其试剂空白的读数，用下式计算供试品浓度： R<>-R<[ib]> C<>＝──×C<[r]> R<[r]>－R<[rb]> 式中 C<>为供试品溶液的浓度； C<[r]>为对照品溶液的浓度； R<>为供试品溶液的读数； R<[ib]>为供试品溶液试剂空白的读数； R<[r]>为对照品溶液的读数； R<[rb]>为对照品溶液试剂空白的读数。 因荧光分析法中的浓度与读数的线性较窄，故(R<>－R<[ib]>)/(R<[r]>－R<[rb]>)应为0.50～2.0；如有超过，应在调节溶液浓度后再测。 对易被光分解的品种 ,可选择一种激发光和发射光波长与之近似而对光稳定的物质溶液，例如蓝色荧光可用硫酸奎宁的稀硫酸溶液，黄绿色荧光可用荧光素钠水溶液，红色荧光可用罗丹明B水溶液等,先与对照品溶液比较测定其读数关系，并在测定供试品溶液时用以代替对照品溶液，以校定仪器的灵敏度。 荧光分析法因灵敏度高，故干扰因素也多。溶剂不纯会带入较大误差，应先作空白检查，必要时，应用玻璃磨口蒸馏器蒸馏后再用。溶液中的悬浮物对光有散射作用，必要时，应用垂熔玻璃滤器滤过或用离心法除去。所用的玻璃仪器与测定池等也必须保持高度洁净。温度对荧光强度有较大的影响，测定时应控制温度一致。溶液中的溶氧有降低荧光作用，必要时可在测定前通入惰性气体除氧。