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主题：【分享】梯度洗脱注意事项

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省部重点实验室

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发表于：2011/03/20 18:45:19 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

梯度洗脱，是分离难分离物质的常用手段—-这句话怎么这么难听？其中有些问题是必须要注意到，因为会损伤色谱柱和色谱的流动池或检测池，这都是色谱仪器的死穴。

有些资料整理自网络，有些事工作的总结，我也分不清彼此，属于水乳交融你中有我我中有你的情况。

1、何为空白梯度洗脱梯度洗脱由于是两种流动相随时间变化，即使在优秀的分析匠、在性能卓越的色谱仪都不可能出现非常好的基线，这就要求做空白梯度洗脱。啥叫空白？不用我告诉你吧，而取巧的办法是进一针流动相，看看基线中的杂峰。不要像某些人一样，看到峰就故作明白的说：“呀！鬼峰”经常有这类SB在我身边晃来晃去，然后你要接着问要探讨一下的时候，就以沉默对抗无知。我虽然没查过鬼峰的概念，但是也知道，莫名其妙、偶尔出现、具有鬼的特点的峰，才能叫鬼峰，基线上的峰你鬼峰个头啊！

2、要注意溶剂的互溶性这是大家经常忽略的问题，而这个问题的严重性还很高，严重了直接把色谱柱给你堵了。到时候那真就叫天天不应，叫地地不灵了。比如说有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵（pH5.16）做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶，甲醇和已烷混合，甲醇含量高于30%时就会分层等。当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。所以，掌握，做梯度洗脱先要了解流动相当互溶性，如果使用比例互溶的流动相，就更应该注意这个问题，不要自作主张胡乱更换流动相当比例。没准你轻轻鼠标一点，就结束色谱柱的大好钱途呢。

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2011/3/20 18:45:33 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3、试剂的纯度梯度洗脱要想保证好的重现性，溶剂的纯度要求更高，脱气在这里也成为了必须保质保量完成的任务，因为有些溶剂互溶的时候，脱气不好会产生气泡。

4、试剂的黏度做梯度洗脱的同志，会发现压力波动范围变大，不要大惊小怪，由于溶剂黏度不同，当变化较快的时候，肯定会出现压力波动现象。比如用醋酸溶液和乙腈作为流动相，由于乙腈的黏度小于醋酸溶液，因此当乙腈比例提高时，压力会下降。还有个例子，纯水或甲醇的粘度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时粘度会增大很多，此时的柱压是纯水或甲醇为流动相时的两倍。当然，不要让柱压超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。

5、色谱柱再生再生这个词用在这里似乎有些不妥，准确的说法是使色谱柱恢复到初始的状态。需让10～30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡！好了，就说这些吧！

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xiongbb

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2011/3/26 11:37:26 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

楼主....说脏话

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yinghuan

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2011/4/9 14:25:01 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

学习，嘿嘿，努力

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神话

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2011/4/29 7:05:37 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 省部重点实验室(gl19860312) 发表:
1、何为空白梯度洗脱梯度洗脱由于是两种流动相随时间变化，即使在优秀的分析匠、在性能卓越的色谱仪都不可能出现非常好的基线，这就要求做空白梯度洗脱。啥叫空白？不用我告诉你吧，而取巧的办法是进一针流动相，看看基线中的杂峰。不要像某些人一样，看到峰就故作明白的说：“呀！鬼峰”经常有这类SB在我身边晃来晃去，然后你要接着问要探讨一下的时候，就以沉默对抗无知。我虽然没查过鬼峰的概念，但是也知道，莫名其妙、偶尔出现、具有鬼的特点的峰，才能叫鬼峰，基线上的峰你鬼峰个头啊！

其实他们不是懂不懂得问题,而是对事物的认识永远处在幼稚的状态,没办法..他们要想进步,除非他们要真正的用心

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雪妖

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2011/5/20 13:34:25 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

哈哈，楼主的话很经典，很实在，特别是对鬼峰的概念。

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2011/7/26 9:54:21 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

等度分离在洗脱全过程中流动相组成不变（例如50%甲醇-水），而在梯度洗脱中流动相组成随运行过程是变化的（例如5→100%甲醇-水）。梯度洗脱中一般采用二元（溶剂）流动相：A与B，其中强溶剂B的浓度（%B）在运行过程中逐渐增加。

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2011/7/26 9:55:45 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

许多样品用梯度洗脱会分离更好，但许多实验室却对梯度洗脱的应用存在很大偏见。其原因有如下几点：

1、有些实验室尚不具备梯度洗脱设备。

2、梯度洗脱更复杂，似乎更难进行新方法建立与常规分析。

3、某些HPLC检测器（如示差折光检测器）不能使用梯度洗脱。

4、每次运行梯度洗脱后需重新平衡色谱柱，耗时较长。

5、不同设备的分离结果可能不同，所以梯度洗脱法移植时会出现差异。

6、梯度洗脱中的基线问题更为普遍，并且必须使用高纯溶剂。

7、某些色谱柱╱流动相的联合应用不适于梯度洗脱。

如权衡采用梯度洗脱对每一分离的优缺点，那么很多分离将只适于使用梯度洗脱。

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2011/7/26 9:57:11 8楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

梯度洗脱的应用

1、具有较宽k值范围的样品（即等度条件下不可能使所有谱峰达到0.5<k<20）。

2、大分子样品（如分子量大于1000，尤其是生物样品）。

3、样品含有晚流出干扰物，它们会污染色谱柱或在后续运行中流出。

4、溶于弱溶剂的样品稀溶液（如用反相柱分离的样品水溶液）。

此外，即使最终有可能使用等度方法，初始实验采用梯度洗脱往往是HPLC方法建立的最佳起点。

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