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主题：【求助】蛋白质的酶解问题

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trytotry

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发表于：2011/03/24 13:21:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

本人初来乍到，老板让查下蛋白质酶解的资料，什么方法？条件？试剂？哪位大虾知道？能否简单介绍一下？着急呀

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2011/3/24 16:21:08 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

建议你先在cnki等数据库中找些这些方面的论文看看，有个基础的理解。。。

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2011/3/25 9:24:52 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

蛋白酶解我大概了解。利用蛋白酶选择性的把蛋白质的某些特定肽键打开，比如用胰蛋白酶酶解蛋白质，37度过夜反应。最终结果涉及到平均分子量，为什么要检测平均分子量呢？

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2011/3/29 8:48:03 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

能否讲具体的计算方法和检测方法贴出来，让大家帮你分析下。。

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2011/4/1 11:19:27 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我们之前测蛋白质序列都是送到外面测试的，之前我们就关心结果。但是这几次测试的结果让我们觉得不是特别满意，可信度不高。所以就开始找问题，是不是我们的样品纯度有问题？是不是酶切有问题？所以才涉及到了蛋白质酶解的问题了。听说有人在恒温培养箱里做的？不知道效果怎么样。我也问过几个测试机构，他们有的说酶切很容易，蛋白酶的选择性很好的，其他种类的肽键是打不开的；但是有些机构就说酶切受各种因素影响，可能会产品各种碎片峰。真是不知道该信谁。另外酶切时蛋白质是否变性，对效果影响很大吗？

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2011/4/2 9:11:27 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

蛋白质变性肯定对酶切效果大了。
酶切也是对蛋白质结构中的特定的化学键来进行的，如果变性了，其化学键就发生了变化，这样酶切出来的蛋白质片段就不是原本要切断的片段了。

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tianru的爸爸

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2011/4/6 15:35:34 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

楼主的目的是什么？知道吗？

如果知道，就有目的地查资料，这样有用。
如果不知道，就问老板去，要不你就随便找些资料就可以了。

“蛋白质的酶解”是一个大课题，否则没有3、5年你是不能将整个命题弄明白的，但有一个明确的目标，就有可能在短时间内弄清楚，并完成这个目标了。

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2011/4/8 9:44:50 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

据我了解，现在很多人做酶切都会先将蛋白质变性的，变性的目的就是改变蛋白质的二级结构，主要是破坏原有的氢键，使得更多的肽键裸露在外，提高酶切的准确性。但是也有不少单位是直接酶切不做变性处理。不知道这两种办法的差别在哪里？
另外，我的主要目的是想问下：各位做过酶切的大侠能否详细叙述一下您的操作流程？或是有没有什么工具可以方便准确地做酶切？

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lxg201211

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2011/4/11 10:17:48 8楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

可以尝试一下微波蛋白酶切仪，我们组就在用，胰蛋白酶8分钟搞定，没发现什么杂峰

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tianru的爸爸

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2011/4/18 16:07:02 9楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 trytotry(trytotry) 发表:
据我了解，现在很多人做酶切都会先将蛋白质变性的，变性的目的就是改变蛋白质的二级结构，主要是破坏原有的氢键，使得更多的肽键裸露在外，提高酶切的准确性。但是也有不少单位是直接酶切不做变性处理。不知道这两种办法的差别在哪里？

两个过程是有区别的，如果不变性，一般是不能得到完全酶切的，因为可能有部分酶切位点位于蛋白质内部。
另外一个区别是：不变性的酶切产物有的二硫键，会出现二硫键断裂与重建的平衡，出现三个多肽段，而变性处理的是连个多肽段。

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2011/4/18 16:10:17 Last edit by lxdongzi2003

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2011/5/18 10:26:24 10楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 dong3626(dong3626) 发表:
蛋白质变性肯定对酶切效果大了。
酶切也是对蛋白质结构中的特定的化学键来进行的，如果变性了，其化学键就发生了变化，这样酶切出来的蛋白质片段就不是原本要切断的片段了。

蛋白质变性主要是破坏蛋白质的2、3、4级结构，主要是氢键及其他作用力，氨基酸顺序是不会发生变化的，所以酶切出来的肽段的序列是正确的，只不过没有空间结构了，基本成为了一条线。打个比方：变性后的蛋白质就是一条绳子，蛋白酶就是特殊剪刀。剪刀会在特定的位置剪开就是了。如果不先对蛋白进行变性，蛋白会保持原有的空间结构，弯曲、折叠等等，这会使得反应位点被包埋住，很难完全切开。

我的问题是：酶切效果好坏与测序得到的覆盖率高低有联系吗？为什么分子量越大，得到的覆盖率越低？因为理论上，蛋白质会被完全切成小肽段，分子量大也就是肽段数量多了些，难道会有这么大的影响？因为我知道肌血球素覆盖率能达到80+%,而BSA仅仅 20+%。

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