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主题：【分享】ELISA实验质量控制问题

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发表于：2011/04/14 18:58:37 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.1.1 质量控制(Quaility Control,Q.C)
　　质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这
一过程是通过一个反馈环路进行的。
　　1)确定控制的对象；
　　2)规定控制对象的标准(预期值)；
　　3)制定或选择控制方法和手段；
　　3)测量实际数据；
　　4)比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预
　　　　定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。
　　5)采取行动，解决差异。恢复原状(原标准状态)的手段发挥作用。
　　质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期
的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来
的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查"性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去
随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍(见
1.3.室内质控程序)。
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2011/4/14 18:59:05 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.1.2 误差
　　实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。
　　系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律
性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。
　　随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误
差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。
　　过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免
的。

1.1.3 正态分布及标准差
　　ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据(指测定结果的吸光
值)分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为
纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为
中心对称分布，这就是正态分布。
换言之，当ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值(X)的
±1SD范围内的数据，占该组数据的68%，在X±2SD范围内分布的数据占总体的95%，
在X±3SD范围内分布的数据占总体的99%。当我们要求检验结果在X±2SD范围内为合格
时，将有95%的数据可能合格。

1.1.4 真值
　　用确切的、最理想的决定性方法测得的值，称为真值。真值一般是测不到的。通过可
靠的决定性方法测出的值，称为靶值，通常用靶值来表示真值的大小。

1.1.5 准确度(accuracy)
　　是指测定结果与真值(或靶值)接近的程度。准确度不能以数字表示，往往用不准确
度来衡量。测定结果与靶值的偏离程度称为偏差，它表示该项检验的不准确度。
　　绝对偏差=检验的均值-真值(或靶值)
　　相对偏差=绝对偏差真值÷(或靶值)×100%

1.1.6 精密度(Precision)
　　是指对同一样本重复测定时，每次测定结果与平均值的接近程度，即重复测定值之间
的符合程度。
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2011/4/14 19:04:27 Last edit by 7336167
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2011/4/14 18:59:33 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.1.7 标准品
1、国际标准品 由WHO或相应组织标定的，用肯定的、公认的、准确的物理或化学方法
　　测定的定值材料。
2、国际生物学活性标准品根据生物学反应由WHO或相应组织标定的国际活性单位的材
　　料。
3、参考标准血清 国家标准化组织根据国际标准化生产的法定材料。可用于鉴定仪器和
　　鉴定方法准确性。 

1.1.8 临床决定性水平(clinical decision leuel)
　　当某个被测物的浓度达到某一水平时，临床医师必须采用医疗措施。被测物的这浓度
称为临床决定性水平。

1.2质量控制血清
　　质控血清是已有靶值的血清，在每次的常规检验中加入一份或数份，通过所得结果来
了解本次检验的情况。质控血清检验的结果如能控制其误差在一定范围内，就说明该检验
没有发生不允许的误差。如果出现超过允许误差范围的异常结果，提示该检验不合格，应
寻找原因，纠正后，重检待测标本。因此质控血清在质控工作中起重要作用。

1.2.1 质控血清的使用
　　卫生部临床检验中心制备的乙肝标志物质控血清，可以在-20℃保持半年定值不变。
冰冻状态融化使用时，应先混匀，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反复冰融或自行分
装。开展某项检验的室内质控工作需要的质控血清，一般按3-6个月用量准备。自制的不
定值质控血清，在一批质控血清将用完之前，需准备下一批质控血清。质控血清要求性能
稳定，较长期内效价不变，其理化性质应与病人样本相近，这样才能有效地起到监测作
用。
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2011/4/14 19:04:36 Last edit by 7336167
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2011/4/14 19:00:19 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.2.2 临界值质控血清
　　质控制血清分定值和未定值两种。如只用一份质控血清定值，一般定在正常值与异常
值交界点上，定性测定时处于弱阳性水平，称为临界值。乙肝标志物临界值的制定，应按
临床要求，为临床提供统一的判断弱阳性的标准。 
临界值质控血清可以作为试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品以外的第三个对照品，它可
以灵敏地反映出试剂盒的检出水平，确保弱阳性反应的标本不漏检。
1.2.3 质控血清的制备
每个实验室可以根据自己的条件，选用临床中心提供的质控血清，或按以下方法自己制备
本室使用的质控血清(以乙肝质控血清为例)。
1) 收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清。
2) 56℃加热10小时来活。
3) 离心或过滤除去沉淀。
4) 用10%的小牛血清或正常人血清(PBS缓冲液)将收集的血清稀释至所需的浓度。如
　　能用正常的人血清稀释更好，因其成份更接近于检测标本。
5) 抽滤除菌。按一次使用的量分装小安瓿，封口，20℃保存备用。不可反复冻融。
　　被检物要求检出的水平常被认为是质控血清应选择的水平。如果该试验还有其它要
　　求，则应加所要求浓度的质控物。
6) 标定含量。20-30次测定结果删除>±2SD数据的均值作为靶值，并与已知定值血清对
　　比测定。
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2011/4/14 19:00:44 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.3 室内质量控制程序
　　临床检验的检测结果，每次或每天之间不可能没有误差。决定允许的误差范围，以临
床上不造成误诊与漏诊为准，通过以下步骤来确定质控范围。
1) 最佳条件下的测定误差。
2) 已知值的血清在常规检验条件下的误差。
3) 未知值的血清在常规检验条件下的误差。
4) 临床应用的要求。对任何一个试验都应确定一个允许的误差范围，前题是满足临床要
求。如允许误差定得过小，在临床上不存在任何意义，但为了符合该规定却要花费很大人
力、物力和时间。相反，如果将允许误差定得过大，将使监测系统察觉不到临床上要求检
出的误差，失去质控的意义。

1.3.1 最佳条件下已知值质控血清变异(optimal conditions variance,简称OCV)的测定
　　在本实验室最佳条件下(包括操作者、试剂、仪器等)检测质控血清20-30次，测得
结果计算，求出该组数据的均值和标准差(SD)表示该实验室的最佳工作质量。
　　现举例说明HBsAg ELISA法检测时OCV的测定。使用的质控制血清为临界血清，
HBsAg浓度为5ng/ml。在该实验室中选择素质最好、操作最熟练的技术员进行认真地专门
测定，选用最佳的试剂盒，检测之前，将恒箱、加样器等认真校正、调校正、调试，使用
新的加样吸头等，即在最佳、最理想的条件下进行检测。除质控血清外同时测定阴性对照
品和阳性对照品。并作双份测定，得出2个吸光值(A值)，求出X。连续作20次，求出20
个X，即X1……X20。从这20个数据中，求出OCV的X和SD。

1.3.2常规条件下已知值质控血清变异(routine conditions variance-known value,简称
　　RCVK)的测定。
　　做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进
行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。
若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后(例如较正加样
器，纠正洗板操作，调正温育温度等)，重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更
小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比
OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映
该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结
果，报告能否发出。

1.3.3常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称
　　RCVU)的测定
　　有时为了避免主观性,再作RCVU测定。
　　测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质
控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。
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2011/4/14 19:01:17 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.3.4质控图
　　通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控
图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，
该质控图可以连续作下去。 
　　质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的
原因。
　　ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举
例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清
时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出
现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血
清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进
行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。
一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；
　　　　　④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。
第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失
控。

1.3.5统计学计算方法--"即刻性"质控
　　以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但ELISA有其特殊性，
最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA
试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方
法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。
"即刻法"的建立具体计算方法如下：
1)先将测定值从小到大排列
2)计算X和SD。
3)计算SDI上限和SDI下限值。
4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表
　示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限
　有 一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于"告警"状态；当
　SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属"失控"。数值处
　于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控
　的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。
　　即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。
　　当检测的数值超过20次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质
控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即
可。
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2011/4/14 19:01:39 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1.4室间质量评价(external quality assessment,简称EQA)
　　室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各
实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差
异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出
相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评
价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能
互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。 

1.4.1室间质评的方法
1、 发质控物进行调查
　　这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采
用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临
检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本
室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。 
　　这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂
盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果
不能反映该实验室日常工作水平。
2、 派观察员到实验室进行试剂调查
　　这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组
标本，进行评价。
　　这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决
问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。
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2011/4/14 19:02:20 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
1 培养基、抗血清和试剂对微生物检验质量的影响

1.1 购置培养基、抗血清和试剂时要求供应商提供产品质控证书，尽量选择通过ISO9000认证的生产厂家。

使用前首先对外观、批号、pH 值、灭菌要求、选择性等进行初步评估，用阳性和阴性对照菌株做质量控制实验，要按照培养基和试剂标签说明的贮藏条件保存，自配的染液每周必须作质控。如有条件可参照国际食品微生物与食品卫生委员会提供的关于培养基质控方法进行质控。

1.2 使用 培养基的使用应在有效期内，开封后的保存、制备过程中器皿管壁的洁净度以及配制时的pH值要严格按规定控制，不同批号的培养基和试剂不要混合使用。目前市售的大多数为半成品培养基，无论是分装后灭菌，还是无菌分装，都应进行严格的无菌试验，证明无菌生长后才能使用。从可靠来源获得的诊断血清应注明收到的日期，如为冻干制品，还应注明配成水溶液的日期。使用前检查外观应清澈，如出现混浊表示己被杂菌污染。使用时应注意其有效期和滴度，使用前用标准菌株试验其敏感性和特异性。
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2011/4/14 19:05:07 Last edit by 7336167
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2011/4/14 19:03:12 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
2 培养基的储存

干粉培养基应保存在阴凉干燥处，要避免阳光直射；未开瓶的培养基在室温下的最长保存2年，开瓶后的干粉培养基易吸湿，应注意防潮并在6个月内用完。应定期对储存中的培养基进行常规检查，如容器密闭性复查、首次开封日期、内容物的感官检查，如果培养基发生结块、颜色异常和其他变质迹象就不能再使用。

3 培养基的性能测试

3.1 外观控制制备好的培养基应有相应的颜色，一般的培养基应澄清、无浑浊、无沉淀。使用前应检查培养基的颜色是否发生变化，是否蒸发／脱水。

3.2 污染控制 从每批制备好的培养基中选取部分进行污染测试(无菌试验)，确定无微生物生长方可使用。

3.3 性能测试

3.3.1 测试菌株选择测试菌株是具有其代表种的稳定

特性并能有效证明实验室特定培养基最佳性能的一套菌株，应来自国际／国家标准菌种保藏中心ATCC标准菌株，菌株的选择参考卫生行业标准WS/T232-2002《商业性微生物培养基质量检验规程》。

3.3.2 定量测试方法改良Miles-Misra法测试菌株过夜培养物10倍递增稀释；测试平板和参照平板划分为4个区域并标记；从最高稀释度开始，分别滴一滴稀释液于试验平板和对照平板标记好的区域；将稀释液涂满整个1/4区域，37℃培养18小时；对易计数的区域计数，按公式计算生长率(生长率=待测培养基平板上得到的菌落总数／参考培养基平板上获得的菌落总数)。非选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.7，该类培养基应易于目标菌生长；选择性培养基上目标菌的生长率应不低于0.1。

3.3.3 半定量测试方法 改进的划线法接种法平板分ABCD四区，共划16条线，平行线大概相隔0.5cm，每条有菌落生长的划线记作1分，每个仅一半的线有菌落生长记作0.5分，没有菌落生长或生长量少于划线的一半记作0分，分数加起来得到生长指数G。目标菌在培养基上应呈现典型的生长，而非目标菌的生长应部分或完全被抑制， 目标菌的生长指数G大于6时，培养基可接受。

3．3．4 定性测试方法平板接种观察法用接种环取测试菌培养物，在测试培养基表面划平行直线。按标准中规定的培养时间和温度对接种后的平板进行培养， 目标菌应呈现良好生长，并有典型的菌落外观、大小和形态，非目标菌应是微弱生长或无生长。
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技术的-操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA 检测结果准确可靠的必要条件。ELISA 的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA 各个操作步骤的
注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严
格遵照规定操作，必能得出准确的结果。
4.1 标本的采取和保存
可用作 ELISA 测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等
均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预
处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA 检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝
剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收
缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA 中血浆和血清可同等应用。
血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以
HRP 为标记的ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性 HRP，也会产生假
阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法 ELISA 中可使本底加深。
一般说来，在 5 天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清
融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，
不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反
复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰
存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。
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